İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Nöral Organoidlere Farklılaşması ve Olgunlaşması

Özet

Kaynak: Cosset, E., et al. Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkları incelemek için insan nöral organoidleri. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, İnsan embriyonik kök hücrelerinin nöral organoidlere dönüştürülmesi için aşamalı bir protokol gösterilmektedir. Yöntem, nöronal rozet oluşumunun indüklenmesini, ardından tam gelişmiş nöral organoidler elde etmek için kontrollü olgunlaşmayı ve hidrofobik bir zar üzerinde son kültürlemeyi içerir.

Protokol

1. Farklılaşmamış insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) bakımı ve kültürü

1. Bulaşıkları belirli bir hücre dışı matrisle önceden kaplayarak besleyicisiz koşullarda hSEC'lerin bakımını ve genleşmesini gerçekleştirin.
   1. 300 μL hücre dışı matrisi 4 ° C'de çözün (tipik aralık konsantrasyonu 18-22 mg / mL, buz üzerinde tutun) ve hücre dışı matrisin erken jelleşmesini önlemek için 15 mL soğuk DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium) ortamı ile hafifçe karıştırın. Her iki T150 şişesine 7.5 mL hücre dışı matris ekleyin.
   2. Hücre dışı matriks ile kaplanmış bulaşıkları 37 °C'de en az 1 saat (en fazla gece boyunca) inkübe edin.
   3. Ortam ve tohum hESC'lerini 6,5 x 104 hücre/^cm2 yoğunluğa kadar çıkarın.
2. H1'i (hESC hücre hattı) hESC ortamında ve% 1 penisilin / streptomisin içinde tutun.
3. Hücreleri enzimatik prosedürle geçirin: 37 ° C'de 1-2 dakikalık bir süre boyunca bir T75 cm2 şişesine 7,5 mL enzimatik çözelti ekleyin. Hücreler tamamen ayrıldıktan sonra, 7.5 mL DMEM-F12 ekleyin ve ardından 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Daha iyi sağkalım sağlamak için, hücreleri 24 saat boyunca Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü (10 μM) içeren aynı ortamda hücre dışı matris kaplı tabaklara istenen yoğunlukta yeniden plakalayın.

2. hESC'den türetilmiş nöral organoidler

1. 3D kültüre başlamadan 24 saat önce, hESC ortamını 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş serumsuz bir ortamla değiştirin (her iki bileşen de bir mikrokuyu plakasında agregasyon aşaması sırasında hücre sağkalımını ve spontan nöroküre oluşumunu desteklemek için gereklidir). Hücreler% 60 birleşim noktasında olmalıdır. Ertesi gün (0. gün), hESC kolonilerini tek hücreler halinde ayırın: ortamı çıkarın, Ca^{2 +} / Mg^{2 +} içermeyen PBS ile durulayın, 5 mL enzimatik çözünme çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1-2 dakika inkübe edin.
2. Hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş serumsuz ortamda toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 10 mL serumsuz ortamda sayın.
3. Paralel olarak, mikrokuyu plakasını oyuk başına 2 mL serumsuz ortamla durulayın ve nörosfer oluşumunu önleyebilecek tüm kabarcıkları çıkarmak için plakayı 5 dakika boyunca 1200 x g'da santrifüjleyin.
4. 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 12.5 mL serumsuz ortamda 28.2 x^{10 6} hücre hazırlayın. 1000 hücre / mikrokuyu dağıtın. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve plakayı gece boyunca 37 ° C'de (maksimum 36 saat) inkübatöre yerleştirin. Örneğin, 30 insan nöral organoidi elde etmek için, birleşmenin %70-80'inde (yaklaşık 30 milyon hücre) bir T150 şişesi kullanın.
5. Ertesi gün (1. gün), küreleri toplayın (P1000 ile) ve 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Her oyukta, %1 B27 takviyeleri ve %1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) ile desteklenmiş 2 mL B27 ortamı ve DMEM-F12 GlutaMAX ve Nörobazal ortam (1:1'de karıştırın) ekleyin. Hızlı nöral indüksiyonu teşvik etmek için, ortamı 10 μM TGFβ (Dönüştürücü Büyüme Faktörü-beta) / Aktivin / Nodal inhibitör ve 0.5 μM kemik morfojenik proteini (BMP) inhibitöründen oluşan bir çift SMAD (Sma ve Mad Related Protein) inhibisyon kokteyli ile destekleyin. Bu adımdan itibaren, küreler rotasyonda kültürlenir (60 rpm, orbital çalkalayıcı). Dönüş, kürelerin birbirine veya plakaya yapışmasını önlemek için kritik öneme sahiptir.
6. Ortamı her 2-3 günde bir değiştirin: plakayı bükün ve kürelerin 5 dakika düşmesine izin verin, ortamın yarısını (2 mL) çıkarın ve büyüme faktörleri ve inhibitörlerle desteklenmiş 2 mL taze B27 ortamı ekleyin. Küreleri santrifüjlemeyin.
7. Aşağıdaki zaman seyrine göre nöral indüksiyon gerçekleştirin:
   1. 1-4. günler arasında, küreleri çift SMAD ile desteklenmiş B27 ortamında kültürleyin. Çift SMAD inhibisyon kokteyli (10 μM TGFβ / Aktivin / Nodal inhibitör ve 0.5 μM BMP inhibitörü) nöral indüksiyonu destekler.
   2. 4-11. günler arasında, çift SMAD kokteyli ile desteklenmiş B27 ortamına 10 ng / mL epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 10 ng / mL bazik fibroblast faktörü (bFGF) ekleyerek hESC türevi nöral rozetlerin (kürelerin içine) proliferasyonunu teşvik edin.
      not: 11. günde, çoğu hücre Nestin için pozitif olmalıdır.
   3. 11-13. günlerden itibaren, küreleri 0.5 μM BMP inhibitörü ile desteklenmiş B27 ortamında kültürleyin.
   4. 13-21. günlerden itibaren, 10 ng / mL glial kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF), 10 ng / mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ve 1 μM γ-sekretaz inhibitörü ile desteklenmiş B27 ortamındaki küreleri kültürleyin. GDNF ve BDNF, nöronal ve glial farklılaşmayı teşvik eder. γ-sekretaz inhibitörü, daha fazla nöral olgunlaşmaya izin verir.
   5. 21. günde, küreleri (yaklaşık 1.000 küre), 6 oyuklu plaka için tasarlanmış bir kültür plakası eki üzerine yerleştirilmiş bir hidrofilik politetrafloroetilen (PTFE) membran (6 mm çap, 0.4 μm) üzerine yerleştirin. Bu adımdan herhangi bir döndürmeyi durdurun. Parlak alan mikroskobu ile gözlemlenen rozetlerin varlığı, nöral farklılaşmanın başladığını gösterir. Nöral rozetler, PTFE membran üzerine kürelerin kaplanmasından 2-3 gün sonra gözlemlenebilir.
   6. Takip eden 3 haftalık farklılaşma için her 2-3 günde bir (genellikle Pazartesi, Çarşamba ve Cuma günleri) membran ekinin altındaki her bir kuyucuğa büyüme faktörleri ve inhibitörler (takip edildiği gibi) ile takviye edilmiş 1 mL B27 ortamı ekleyin.
   7. 21-25. günler arasında, insan nöral organoidlerini aynı nöral olgunlaşma ortamında yetiştirin.
   8. 25-28. günler arasında, B27 ortamını sadece 1 μM γ-sekretaz inhibitörü ile tamamlayın.
   9. 28-39. günlerden itibaren, γ-sekretaz inhibitörünü eklemeyi bırakın ve insan nöral organoid kültürüne sadece B27 ortamında devam edin.
      not: 3 hafta sonra, nöral organoidler GIC implantasyonu için kullanıma hazırdır. Nöral olgunlaşma boyunca, nöral olgunlaşmamış belirteç Nestin'de bir azalma ve olgun nöral belirteçler β3-tubulin ve GFAP'de bir artış gözlendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 oyuklu plaka (6 oyuklu plaka)	Şahin / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (Mikrokuyu kültür plakaları)	Kök Hücre Teknolojileri	34421
B27 takviyeleri (B27)	Yaşam Teknolojileri / Invitrogen	1238	Her iki protokol için de stok çözümü 100x, nihai çözüm 1x
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)	Hücre Kılavuzluğu	GFH1-2	Her iki protokol için de saf H2O içinde 100 μg/mL çözelti, nihai çözelti 20 ng/mL stok çözeltisi
Bileşik E, bir γ-sekretaz inhibitörü (γ-sekretaz inhibitörü)	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	CAS 209986-17-4	Her iki protokol için de (gama-sekretaz inhibitörü XXI), DMSO'da stok çözeltisi 5 mM, nihai çözelti 1 μM
Dimetil Sülfoksit Saf (DMSO)	Sigma-Aldrich	C6164	Bileşikler çözücü, kullanıma hazır
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Yaşam Teknolojileri	12491-015	Hücre kültürü için kullanıma hazır
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta Karışımı F-12 (DMEM-F12)	Gibco (Gibco)	11320033	Hücre kültürü için kullanıma hazır
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Yaşam Teknolojileri	AM9912	Hücre kültürü için kullanıma hazır
Glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF)	Hücre Kılavuzluğu	GFH2-2	Her iki protokol için de saf H2O içinde 100 μg/mL çözelti, nihai çözelti 20 ng/mL stok çözeltisi
Hidrofilik politetrafloroetilen membran (PTFE membran)	BioCell-Arayüzü	Üretilmiyor
LDN-193189 (BMP inhibitörü)	Akson Medchem / Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, DMSO'da stok çözelti 5 mM, nihai çözelti 0,5 μM
L-glutamin (L-glutamin)	Gibco (Gibco)	25030081	L-Glutamin (200 mM), stok çözelti 200 mM, nihai çözelti 2 mM
Matrigel (hücre dışı matris)	BD Biyolojik Bilimler	354277	hESC nitelikli Matris, stok çözeltisi 18-22 mg/mL, nihai çözelti 180-220 μg/mL
Millicell-CM Kültür plakası eki (0,4 μm) (Kültür plakası eki)	Kırlangıç	PICM03050
Monoklonal Anti-β-Tubulin III antikoru	Sigma	T8660	1/1000 seyreltme
MS Orbital Çalkalayıcı, MS-NOR-30 (Orbital çalkalayıcı)	Başlıca Bilim	MS-NRC-30
Nörobazal (Nörobazal)	Yaşam Teknolojileri / Gibco	21103049	Bakım ve olgunlaşma embriyonik nöronal hücre popülasyonları, kullanıma hazır
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)	Gibco (Gibco)	11140	Esansiyel Olmayan Amino Asitler 100X, stok çözelti 100x, nihai çözelti 1x
Nurr1 Antikoru (M-196)	Santa Cruz Plajı	SC-5568 Serisi	1/100 seyreltme
Nutristem (hESC ortamı)	Biyolojik Endüstriler	05-100-1A	Kök hücre ortamı, kullanıma hazır
Penisilin / Streptomisin (Penisilin / Streptomisin)	Yaşam Teknolojileri / Gibco	15140122	Hücre kültürü için stok çözeltisi 5 mg/mL, nihai çözelti 50 μg/mL
Ca2 + / Mg2 + içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (Ca2 + / Mg2 + olmadan PBS)	Yaşam Teknolojileri	14190250	Hücre kültürü için kullanıma hazır
Rho ile ilişkili Kinaz Y-27632 (KAYA)	Abcam Biyokimya	AB120129-1	Kaya İnhibitörü, DMSO'da stok çözeltisi 50 mM, nihai çözelti 10 μM
SB-431542 (TGFβ / Aktivin / Nodal inhibitör)	çıkış	ASC- 163	Dual-Smad, DMSO'da stok çözeltisi 50 mM, nihai çözelti 10 μM
StemPro Accutase (hESC enzimatik çözelti)	Gibco (Gibco)	A11105-01	hESC enzimatik çözüm, kullanıma hazır
T150 şişesi (T150 şişesi)	doğan	08-772-1F
Transforme Edici Büyüme Faktörleri beta 3 (TGFβ3)	Hücre Kılavuzluğu	GFH109-2	Dopaminerjik protokol için, saf etanol içinde stok çözeltisi 100 μg/mL, nihai çözelti 1 ng/mL
Tripsin% 0.25 (enzimatik çözelti)	Yaşam Teknolojileri	15050065	enzimatik çözelti, kullanıma hazır
X-vivo (serumsuz ortam)	Fransa	BE04-743Q	Serum İçermeyen Ortam, Size Hazır