İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Dopaminerjik Nöronal Organoidlerin Üretilmesi

Özet

Kaynak: Cosset, E. et al. Beyin Kanseri ve Nörodejeneratif Hastalıkları İncelemek için İnsan Nöral Organoidleri. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, Parkinson hastalığını incelemek için bir model sağlamak üzere insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını göstermektedir. hESC'ler, 3D nöroküreler oluşturmak için bir mikro kuyu plakasında bir nöral indüksiyon ortamında kültürlenir. Bunlar daha sonra dopaminerjik progenitör nöronlara farklılaşmayı teşvik etmek için bir nöral indüksiyon ortamında kültürlenir. Nöronların son olgunlaşması, hava-sıvı arayüz koşulları altında bir kültür ekinde meydana gelir ve olgun dopaminerjik nöronlardan oluşan 3D organoidlerle sonuçlanır.

Protokol

>1. Parkinson Hastalığı (PD) çalışmaları için hESC'den türetilmiş dopaminerjik organoidler

1. Gün 0: hESC'leri 2D kültürde %60'a kadar birleşime kadar yükseltin (0. gün), ardından hESC'lerin pluripotent özelliklerini korumak için kullanılan kök hücre ortamını serum içermeyen bir ortamla değiştirin. Kültür ortamını 0.5 μM kemik morfogenetik protein (BMP) inhibitörü ve 10 μM dönüştürücü büyüme faktörü beta (TGFβ)/Aktivin/Nodal inhibitörü (çift SMAD inhibisyon kokteyli) ile takviye ederek nöral indüksiyonu başlatın, ardından geçiş sırasında hücrelerin hayatta kalma oranını artırmak için 24 saat boyunca 10 μM Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü ekleyin.
2. 1. Gün: 0.5 μM BMP inhibitörü, 10 μM TGFβ / Aktivin / Nodal inhibitörü ve 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş serum içermeyen ortam kuyusu başına 2.5 mL ile mikrokuyu plakasını hazırlayın. Hücreleri nöral tüpün ventral modeline doğru belirtmek için, 100 ng / mL sonik kirpi (SHH), 100 ng / mL fibroblast büyüme faktörü 8 (FGF8) ve 2 μM düzleştirilmiş agonist ekleyin. Mikro kuyucuklardaki hava kabarcıklarını gidermek için plakayı (sadece orta ve hücresiz) 1200 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
   1. 2D'de 1 günlük nöral indüksiyondan sonra, ortamı çıkarın ve Ca^{2 +} / MgCl^{2 +} içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) ile hızlı bir şekilde yıkayın. Bir T75^cm2 şişeye 7.5 mL rekombinant enzimatik çözelti ekleyerek kolonileri tek hücre süspansiyonunda ayırın. 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin, ardından 7.5 mL Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortam/besin karışımı F-12 (DMEM-F12) ile tamamlayın.
   2. Hücre süspansiyonunu toplayın ve 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve mikrokuyu plakasını hazırlamak için kullanılan aynı ortamdaki hücreleri sayın.
   3. Mikrokuyu başına 1000 hücre içeren nöroküreler oluşturmaya izin veren bir hücre süspansiyonu elde etmek için orta hacmi ayarlayın (örneğin, burada kullanılan mikro kuyu plakası kuyu başına 4.700 mikro kuyu içerir). Bu nedenle, 2,5 mL ortamda 4,7 milyon hücre hazırlayın ve bunu plakaya önceden yerleştirilmiş olan önceki 2,5 mL ortama ekleyin.
   4. Hücreleri her bir mikro kuyucuğa doğru şekilde dağıtmak için, plakayı hafifçe sallayın ve mikro kuyu plakasını 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Küreler oluşturmak için plakayı 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
3. 2. Gün: Mikro kuyucukları ortamla nazikçe yıkayın ve toplayın, ardından küreleri doku ile muamele edilmiş altı oyuklu plakaya aktarın. Ortamı% 1 B27, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 2 mM L-glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Nörobazal ortam ile değiştirin. Ek olarak, bölgeselleştirme faktörleri SHH, FGF8, düzleştirilmiş agonist ve çift SMAD inhibisyonu küçük molekülleri ekleyin.
   1. Küreleri 37 °C'de (60 rpm, orbital çalkalayıcı) rotasyona yerleştirin ve her 2-3 günde bir taze takviye edilmiş yarı-orta değiştirin.
4. 3. Gün: Nöral indüksiyonu geliştirmek ve orta beyin kimliğine sahip nöral progenitörlere dönüştürmek için, ortamı Wnt / β-katenin yolunu aktive eden 3 μM Glikojen sentaz kinaz-3 beta (GSK-3β) inhibitörü ile destekleyin. GSK-3β inhibitörünü 13. güne kadar ortamda tutun. Kuyucuk başına hem küre yoğunluğunu azaltmak hem de küre toplanmasını önlemek için dokuyla muamele edilmiş iki yeni 6 oyuklu plakaya bölün.
   not: 8. günde, hücrelerin çoğu Nestin için pozitif olmalıdır.
5. 8. Gün: Nöral olgunlaşmayı başlatın: bölgeselleşme faktörleri SHH, FGF8, düzleştirilmiş agonist ve çift SMAD inhibisyon kokteylini 0.5 mM dibutiril siklik adenozin monofosfat (cAMP) (olgunlaşmayı desteklemek için), 20 nM histon deasetilaz inhibitörü (hücre döngüsü çıkışı için), 1 μM γ-sekretaz inhibitörü ve büyüme faktörleri, 10 ng / mL glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF), 10 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), 1 ng/mL dönüştürücü büyüme faktörü β3 (TGFβ3) ve 5 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 20 (FGF20) (her ikisi de dopaminerjik [DA] progenitör sağkalımını destekler). Ortamı 2-3 günde bir değiştirin.
6. 21. Gün: Nöral organoidi oluşturun: politetrafloroetilen (PTFE membran, 6 mm çap) üzerinde hava-sıvı arayüz koşulları altında yaklaşık 100 nörosfer tohumlayın. Membranı bir kültür plakası ekine (0.4 mm) aktarın ve daha önce tarif edildiği gibi nörosfer farklılaşması için kullanılan 1.2 mL nöral olgunlaşma ortamı ekleyin.
   1. Bu adımdan herhangi bir döndürmeyi durdurun. Gerekli farklılaşma zaman noktası elde edilene kadar ortamı her 2-3 günde bir değiştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 oyuklu plaka (6 oyuklu plaka)	Şahin / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (Mikrokuyu kültür plakaları)	Kök Hücre Teknolojileri	34421
B27 takviyeleri (B27)	Yaşam Teknolojileri / Invitrogen	1238	Her iki protokol için de stok çözümü 100x, nihai çözüm 1x
Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)	Hücre Kılavuzluğu	GFH1-2	Her iki protokol için de saf H2O içinde 100 μg/mL çözelti, nihai çözelti 20 ng/mL stok çözeltisi
CHIR-99021 (GSK-3β inhibitörü)	Akson Medchem	CT99021	Dopaminerjik protokol için, DMSO'da stok çözeltisi 7.5 mM, nihai çözelti 3 μM
Bileşik E, bir γ-sekretaz inhibitörü (γ-sekretaz inhibitörü)	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	CAS 209986-17-4	Her iki protokol için de (gama-sekretaz inhibitörü XXI), DMSO'da stok çözeltisi 5 mM, nihai çözelti 1 μM
Dibutiril siklik-AMP (Dibütiril cAMP)	Sigma	D0627	Dopaminerjik protokol için, DMSO'da stok çözeltisi 0.5 M, nihai çözelti 0.5 mM
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta Karışımı F-12 (DMEM-F12)	Gibco (Gibco)	11320033	Hücre kültürü için kullanıma hazır
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Yaşam Teknolojileri	AM9912	Hücre kültürü için kullanıma hazır
Fibroblast Büyüme Faktörü 20 (FGF20)	Peprotech teknolojisi	100-41	Dopaminerjik protokol için, saf H2O içinde 100 μg/mL çözelti stok, nihai çözelti 5 ng/mL
fibroblast büyüme faktörü 8 (FGF8)	Peprotech teknolojisi	GFH176-5	Dopaminerjik protokol için, saf H2O içinde 100 μg/mL stok çözeltisi, nihai çözelti 100 ng/mL
Glial hücre kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF)	Hücre Kılavuzluğu	GFH2-2	Her iki protokol için de saf H2O içinde 100 μg/mL çözelti, nihai çözelti 20 ng/mL stok çözeltisi
Hidrofilik politetrafloroetilen membran (PTFE membran)	BioCell-Arayüzü	Üretilmiyor
LDN-193189 (BMP inhibitörü)	Akson Medchem / Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, DMSO'da stok çözelti 5 mM, nihai çözelti 0,5 μM
L-glutamin (L-glutamin)	Gibco (Gibco)	25030081	L-Glutamin (200 mM), stok çözelti 200 mM, nihai çözelti 2 mM
Millicell-CM Kültür plakası eki (0,4 μm) (Kültür plakası eki)	Kırlangıç	PICM03050
MS Orbital Çalkalayıcı, MS-NOR-30 (Orbital çalkalayıcı)	Başlıca Bilim	MS-NRC-30
N2 takviyeleri (N2)	Canlandırıcı	17502-048	GIC kültürü için, stok çözeltisi 100x, nihai çözelti 1x
Nörobazal (Nörobazal)	Yaşam Teknolojileri / Gibco	21103049	Bakım ve olgunlaşma embriyonik nöronal hücre popülasyonları, kullanıma hazır
Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA)	Gibco (Gibco)	11140	Esansiyel Olmayan Amino Asitler 100X, stok çözelti 100x, nihai çözelti 1x
Nutristem (hESC ortamı)	Biyolojik Endüstriler	05-100-1A	Kök hücre ortamı, kullanıma hazır
Penisilin / Streptomisin (Penisilin / Streptomisin)	Yaşam Teknolojileri / Gibco	15140122	Hücre kültürü için stok çözeltisi 5 mg/mL, nihai çözelti 50 μg/mL
Ca2 + / Mg2 + içermeyen Fosfat Tamponlu Salin (Ca2 + / Mg2 + olmadan PBS)	Yaşam Teknolojileri	14190250	Hücre kültürü için kullanıma hazır
Purmorfamin (düzleştirilmiş agonist)	Calbiochem (Kireç Biyokimyası	SML0868	Dopaminerjik protokol için, DMSO'da stok çözeltisi 10 mM, nihai çözelti 2 μM
Rho ile ilişkili Kinaz Y-27632 (KAYA)	Abcam Biyokimya	AB120129-1	Kaya İnhibitörü, DMSO'da stok çözeltisi 50 mM, nihai çözelti 10 μM
SB-431542 (TGFβ / Aktivin / Nodal inhibitör)	çıkış	ASC- 163	Dual-Smad, DMSO'da stok çözeltisi 50 mM, nihai çözelti 10 μM
Sonik Kirpi (SHH)	Hücre Kılavuzluğu	GFH168-5	Dopaminerjik protokol için, saf H2O içinde 100 μg/mL stok çözeltisi, nihai çözelti 100 ng/mL
StemPro Accutase (hESC enzimatik çözelti)	Gibco (Gibco)	A11105-01	hESC enzimatik çözüm, kullanıma hazır
T150 şişesi (T150 şişesi)	doğan	08-772-1F
Transforme Edici Büyüme Faktörleri beta 3 (TGFβ3)	Hücre Kılavuzluğu	GFH109-2	Dopaminerjik protokol için, saf etanol içinde stok çözeltisi 100 μg/mL, nihai çözelti 1 ng/mL
Trichostatine A (histon deasetilaz inhibitörü)	Sigma	T8552	Dopaminerjik protokol için, DMSO'da stok çözeltisi 100 μM, nihai çözelti 20 nM
TrypLE (rekombinant enzimatik çözelti)	Canlandırıcı	12604021	Rekombinant enzimatik çözelti, kullanıma hazır
Tripsin% 0.25 (enzimatik çözelti)	Yaşam Teknolojileri	15050065	enzimatik çözelti, kullanıma hazır
X-vivo (serumsuz ortam)	Fransa	BE04-743Q	serum içermeyen ortam, kullanıma hazır

Serisi Serisi ) (İngilizce) Serisi Serisi arası Serisi Serisi Serisi ) (İngilizce) Serisi Serisi Serisi Serisi