NOT: Bu çalışmada kullanılan transgenik hatlar arasında makrofaj spesifik soy mpeg1:mCherry (kurum içinde inşa edilmiştir), nötrofil spesifik mpo: GFP ,eritroid spesifik gata1:dsRed ve ubiq:secAnnexinV-mVenus, vahşi tip, sedef (mitfaw2/w2) ve mutant (bbhm292) arka planlarında hücre ölümü (evde yeniden türetilmiştir) için bir raportördür.
1. Gün 0: Yumurta üretimi ve toplanması
- 1 erkek ve 1-2 dişi yetişkin zebra balığından üretilen üreme kutularında doğal yumurtlamadan döllenmiş embriyoları toplayın.
not: Atorvastatin protokolü için herhangi bir vahşi tip / transgenik hayvan kullanılabilir; Bununla birlikte, kanama oranları suşlar arasında biraz farklılık gösterir.
- 100 embriyoyu 28 ° C'de standart E3 embriyo ortamında Petri kabı başına inkübe edin ve standart yönergelere göre aşamalandırın.
- Döllenmeden ~ 6 saat sonra (hpf), ölü ve döllenmemiş embriyoları bir Pasteur pipeti kullanarak tabaktan çıkarın. Şekil 1'de deneysel zaman çizelgesi gösterilmektedir.
2. 1. Gün: 24 hpf'de atorvastatin tedavisi
- Keskin, ultra ince diseksiyon forsepsleri kullanarak atorvastatin tedavisi için embriyoları dekoryonat. Deney için gerekli sayılar buna göre ayarlanabilir.
- İki temiz Petri kabına 30 mL E3 embriyo ortamı ekleyin. 100 embriyo için bir tabak kullanın.
not: Plakalar hücre kültürü için tasarlanmışsa, bu erken aşamada dekoryonlu zebra balığı genellikle dibe yapışır. Bunu önlemek için, kullanmadan önce plakaları temiz suyla iyice durulayın.
- Tedavi plakasından 60 μL embriyo suyunu çıkarın ve 60 μL 0.5 mM atorvastatin (ATV) ekleyin. 0.5 mM'lik bir stok konsantrasyonunda, yukarıdaki seyreltme, 1 μM'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlanacak ve larvaların ~%20'si kanamasız (ICH-) ve larvaların ~%80'i kanamalı (ICH+) ile sonuçlanacaktır. İşlenmemiş kontroller için diğer plakayı kullanın.
not: Atorvastatin, 0.5 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için damıtılmış suda (3 mg ila 10 mL) çözündürülür. Çözünme biraz zaman aldığından çalkalama ile karanlıkta oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Tam çözünme 1 hafta kadar sürebilir. DMSO (Dimetil sülfoksit) kullanmayın. Çözelti ayıklanır ve -20 ° C'de saklanır. Donma-çözülme.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak, 100 embriyoyu mümkün olduğunca az su içinde tedavi plakalarına aktarın.
- Plakaları 28 °C.
'de inkübe edin
not: ICH (intraserebral kanama) 33 ila 48 hpf arasında ortaya çıkacaktır. Atorvastatinin çıkarılmasına gerek yoktur, çünkü 24 saatten daha uzun süre inkübasyon daha fazla gelişimsel soruna neden olmaz.
3. 2. Gün: ICH- ve ICH+ popülasyonlarının 50 hpf'de ayrılması
- ICH+ balıklarını ICH- popülasyonlarından ayırın ve kolaylık sağlamak için yeni yemeklere aktarın.
- ATV modeli 1 μM'lik bir konsantrasyonda kullanılıyorsa, larvaların %75-100'ü bu zaman noktasında kanama (ICH+) sergileyecektir.
not: Larvaların tepkisi suşlar arasında farklılık gösterir, eğer larvalar istenen frekanslarda kanama görmüyorsa, taze bir atorvastatin partisi veya daha yüksek bir konsantrasyon kullanın. Larvalar 48 hpf kadar kanama göstermediyse, onları ICH- olarak kabul edin.
- İbbh modelini kullanıyorsanız, tüm homozigot mutantlar 48 hpf kanama gösterecektir. Heterozigot bir çaprazlama kullanılıyorsa, ICH- heterozigot ve vahşi tip kardeşler deneyler için kontrol hayvanları olarak kullanılabilir.
- Gerekirse, E3 ortamına% 0.02 MS222 ekleyerek larvaları uyuşturun. Bir Pasteur pipeti kullanarak, larvaları kafadaki kan varlığı açısından taze E3 ortamına ayırın. Bkz. Şekil 2.
not: Kafadaki kan ön, orta veya arka beyinde veya kombinasyon halinde görünebilir ve kanama hacmi hayvanlar arasında değişebilir. BBH mutantlarında, ICH genellikle daha büyük kafalar, gözler arasında daha geniş boşluk ve daha yaygın bir kanama ile tanınabilen şiddetli ödem ile ilişkilidir. Bununla birlikte, tüm ICH + bbh larvaları ödem göstermez.
