Nöral Progenitör Hücrelerde ve Nöronlarda Sialoglikoproteinlerin İmmünofloresan Boyanması

Özet

Kaynak: Bai, Q., et al., Sialoglikanın Metabolik Etiketlemesi ile Primer Nöral Kök ve Progenitör Hücrelerin Hücre Yüzey İşaretleyicilerinin Belirlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, primer nöral kök ve progenitör hücrelerin yanı sıra nöronlardaki modifiye sialoglikoproteinlerin biyotinilasyonunu ve floresan etiketlemesini ve bunların floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilmesini göstermektedir.

Protokol

1. Genişlemiş Primer NSPC'lerde ve Farklılaşmış Nöronlarda Sialoglikoproteinlerin İmmünofloresan Boyanması

1. Çift damıtılmış suda 1.5 mM CuSO 4 ve 9 mM BTTAA içeren BTTAA-CuSO₄ kompleksi₁ 30x stoğu hazırlayın. PBS'de 50 μM biotin-alkin, 2.5 mM sodyum askorbat ve 1x BTTAA-CuS4 kompleksi içeren taze biotin konjuge tampon 1 hazırlayın.
2. Ekleri ko-kültür plakalarından çıkarın. Kültür ortamını alt kuyucuklardan aspire edin ve nöral hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın.
3. PBS'yi kuyulardan aspire edin. Hücrelere oyuk başına 1 mL önceden soğutulmuş% 4 paraformaldehit PBS çözeltisi ekleyin ve bunları 10 dakika boyunca RT'de sabitleyin. Ardından, hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın.
4. Kuyucuklardan PBS'yi aspire edin ve hücrelere her kuyucuk için 1 mL taze hazırlanmış biyotin konjuge tampon 1 ekleyin. Hücreleri RT'de 10 dakika inkübe edin.
5. Reaksiyon tamponunu kuyulardan aspire edin. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın. % 1 FBS ve 1 μg / mL Alexa Fluor 647-streptavidin içeren boyama tamponunu hazırlayın. Hücrelere oyuk başına 1 mL boyama tamponu ekleyin ve hücreleri RT'de 30 dakika inkübe edin.
6. Boyama tamponunu kuyulardan aspire edin ve hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın. PBS'de %5 BSA ve %0.3 iyonik olmayan deterjan-100 içeren bloke edici tamponu hazırlayın. Hücrelere oyuk başına 1 mL bloke edici tampon ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin.
7. Anti-nestin ve anti-β-tubulin III antikorlarını sırasıyla 1:20 ve 1:1.000 oranlarında bloke edici tampona seyrelterek bir birincil antikor çözeltisi hazırlayın. Bloke edici tamponu kuyucuklardan çıkarın ve hücrelere oyuk başına 1 mL birincil antikor çözeltisi ekleyin. Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
8. Birincil antikor çözeltisini kuyucuklardan çıkarın. Hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın. Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG1, Alexa Fluor 546 keçi anti-fare IgG2b ve DAPI'yi 1: 1,000'lik bir seyreltmede bloke edici tampona seyrelterek ikincil bir antikor çözeltisi hazırlayın. PBS'yi kuyucuklardan aspire edin ve hücrelere kuyucuk başına 1 mL ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Hücreleri RT'de 2 saat inkübe edin.
9. Antikor çözeltisini kuyucuklardan aspire edin ve hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile 3 kez yıkayın. Daha sonra, hücreler görüntü yakalama için hazırdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fetal sığır serumu	Gibco (Gibco)	10099141	%10
Paraformaldehit	Sigma	158127	%4
DAPI (DAPI	Gibco (Gibco)	62248
6 oyuklu plaka	Corning	3335
Fare monoklonal anti-Nestin	Gelişimsel Çalışma Hibridoma Bankası	Sıçan-401	1 ila 20
Fare monoklonal anti-beta-tubulin III	Sigma	T8860	1 ila 1000
Alexa Fluor 488 keçi anti-fare IgG1	Canlandırıcı	A-21121	1 ila 1000
Alexa Fluor 546 keçi anti-fare IgG2b	Canlandırıcı	A-21143	1 ila 1000
Triton X-100	Amresco Belediyesi	694
Bakır sülfat	Sigma	209198
Alkin-biyotin	Kimya Araçları'na tıklayın	TA105
BTTAA (BTTAA)	Kimya Araçları'na tıklayın	1236
sodyum askorbat	Sigma	A4034
Alexa Unu 647 konjuge streptavidin	Canlandırıcı	S21374 Serisi	1 ila 1000

) Adet Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi