Agrege Amiloid-β'in Nöronal Büyüme Konisi Çöküşü Üzerine İn Vitro Değerlendirmesi

Özet

Kaynak: Kuboyama, T. Kültürlenmiş Fare Nöronlarında Aksonal Büyüme Konisi Çöküşü ve Erken Amiloid β Etkilerinin Görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, amiloid-β (Aβ) agregatları tarafından nöronal büyüme konisi çöküşünün in vitro değerlendirmesini göstermektedir. Nöronların Aβ agregatları ile tedavi edilmesi, hücre iskeletinin destabilizasyonuna neden olarak aksonların ucundaki büyüme konilerinin çökmesine neden olur. Tedavi edilen hücreler, büyüme konisi çöküşünün derecesini değerlendirmek için kontrol hücreleri ile karşılaştırılır.

Protokol

1. Daralt Testi

1. Poli-D-lizin coating
   1. 8 oyuklu kültür slaytlarını 400 μL 5 μg/mL poli-D-lizin (PDL) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde kaplayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   2. PDL çözeltisini çıkarın ve kuyuları 3 kez damıtılmış suyla yıkayın.
2. Nöron kültürü
   1. Embriyonik gün 14 (E14) ddY (Deutschland, Denken ve Yoken) farelerinden taze izole edilmiş serebral korteksleri% 12 at serumu,% 0.6 glikoz ve% 2 mM L-glutamin (orta A) içeren nöron kültür ortamında mikromakasla kıyın. Antibiyotik eklemeyin.
      not: Bu protokolde ddY fare kullanılır. Bu, Japonya'da yaygın olarak kullanılan soylu bir türdür. Bu nöron kültürü protokolü, sıçan kortikal nöronları için de uygulanabilir.
   2. Dokuları 87 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı çıkarın. Daha sonra pelete 2 mL %0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Her 5 dakikada bir hafifçe vurarak karıştırın.
   4. 4 mL ortam A ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın.
   5. Dokuları 178 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
   6. Süpernatanı çıkarın ve dokuları 600 U / mL deoksiribonükleaz I (DNaz I) ve 0.3 mg / mL soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile 37 ° C'de 15 dakika boyunca PBS içinde çözün. Her 5 dakikada bir hafifçe vurarak karıştırın.
   7. İnkübasyondan sonra 4 mL ortam A ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın.
   8. Dokuları 178 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
   9. Süpernatanı çıkardıktan sonra, 4 mL ortam A ekleyin ve dokuları cilalı bir Pasteur pipeti ile ezin.
   10. Tritüre dokuları 70 μm gözenek boyutunda bir ağ ile filtreleyin. Filtrasyondan sonra, bir hemositometre ile hücrelerin yoğunluğunu hesaplayın.
   11. 8 oyuklu kültür slaytındaki hücreleri, ortam A ile 0.8 x 10⁴ hücre / kuyuda kültürleyin ve bunları 37 ° C'de% 10 CO₂ nemlendirilmiş atmosfere sahip bir CO₂ inkübatöründe tutun.
   12. 4 saatlik kültürlemeden sonra, kültür ortamını nöronal kültür için %2 takviye, %0.6 glikoz ve 2 mM L-Glutamin (orta B) içeren bir ortamla değiştirin.
       not: Nöronların saflığı, daha önce tarif edildiği gibi yaklaşık% 75 idi.
3. Çöküş testi
   1. Ticari olarak elde edilen tam uzunlukta amiloid β1-42'yi (Aβ1-42) damıtılmış suda 0,5 mM konsantrasyonda çözün ve 37 ° C'de 7 gün inkübe edin. İnkübasyondan sonra, agrega Aβ1-42 çözeltisini -30 °C'lik bir dondurucuda kullanılana kadar saklayın.
      not: Bu inkübasyon, Aβ'nın agregasyonu ve toksisitesi için gereklidir.
   2. 4 günlük nöronal kültürden sonra, kuyucukları 1 saat boyunca 0.5 μM agrega Aβ1-42 veya araç çözeltisi (damıtılmış su) içeren 100 μL yeni ortam B ile tedavi edin<> not: Aβ1-42'nin etkileri doza bağlı olarak 0.1'den 5 μM'ye yükseltildi ve daha önce tarif edildiği gibi 0.5 μM'de zirve yaptı. 3 günlük nöronal kültürden sonra 1 saat boyunca Aβ1-42 tedavisi ile benzer sonuçlar gözlenebilir.
   3. Kültür ortamını çıkarın ve nöronları hemen PBS'de %4 sükroz içeren %4 paraformaldehit ile 37 ° C'de 1 saat sıcak bir plaka üzerinde sabitleyin.
   4. Fiksasyondan sonra, nöronları 3 kez PBS ile yıkayın ve sulu bir montaj ortamı ile monte edin. Montaj ortamını 4 °C'de 2-4 gün kurutun.
   5. Ters çevrilmiş bir mikroskopta 20X kuru objektif lensi ile her kuyucuğun tüm alanını (7,8 x 9 mm²) yakalayın.
   6. Her nöronun en uzun nöritlerini, daha önce açıklandığı gibi, aşama 3 veya 4'te akson olarak sınıflandırın.
   7. Büyüme konilerini aşağıdaki kriterlere göre sınıflandırın: 1) lamellipodia içermeyen aksonal büyüme konileri veya 2) üçten az filopodiyaya sahip olanlar, daha önce açıklandığı gibi çökmüş büyüme konileri olarak kabul edilir.
      not: Sağlıklı büyüme konileri 0 puan olarak puanlanır; Çökmüş büyüme konileri 1 puan olarak puanlanır. Her tedavi için ortalama kollaps skorları hesaplanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
ddY fareler	Slc
Sekiz oyuklu kültür slaydı	doğan	354108
poli D lizin	Wako (Vahşi)	168-19041
Kültür ortamı, Nörobazal ortam	Gibco (Gibco)	21103-049
ev serumu	Gibco (Gibco)	26050-088
glikoz	Wako (Vahşi)	049-31165
L-glutamin	Wako (Vahşi)	074-00522
% 0.05 tripsin	Gibco (Gibco)	25300-054
DNaz I	Worthington	Dp
Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü	Gibco (Gibco)	17075-029
70 μm gözenekli filtre, hücre süzgeci	doğan	352350
B-27 takviyesi	Gibco (Gibco)	17504-044
CO2 kuluçka makinesi	Astek	SCA-165DS
Amiloid β1-42	Sigma-Aldrich	A9810
paraformaldehit	Wako (Vahşi)	162-16065
Sakaroz	Wako (Vahşi)	196-00015
Sulu montaj ortamı, AquaPoly/Mount	Poli Bilimler	18606-20
Ters mikroskop A	Carl Zeiss	Axio Gözlemci Z1	AxioCam MRm, Isıtma Ünitesi XL S, CO2 Modülü S1 ve TempModule S1 ile bağlantılı
Objektif Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	420650-9901

Belediyesi Serisi Gazetesi Serisi · ·