Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) için Doku Kesitlerinin Hazırlanması
- İnsan otopsisi yapılmış bir beynin doku örneğinin işlenmesi
not: IMS için numune hazırlama adımının dokunun orijinal durumunu koruduğundan emin olun. Kontaminasyondan ve ölüm sonrası değişikliklerden kaçının. Bir sonraki adım çok önemlidir.
- Ölümden sonraki 8 saat içinde -80 ° C'de çıkarılan, işlenen ve saklanan beyinlerden IMS için insan kortikal örnekleri alın. Alzheimer Hastalığı (AD) hastalarının oksipital korteksinden ve yaşa uygun kontrollerden beyin örneğini alın.
- Donmuş doku kesitlerinin hazırlanması
- Doku bölümlerini bir kriyostat üzerinde kesin. İletken indiyum-kalay oksit (ITO) kaplı mikroskop cam slaytlarını kriyostatın içine yerleştirin.
- Otopsi beyin örneğini kriyostat içinde -80 °C ile -22 °C arasında ısıtın.
- Her deney için kriyostata yeni bir tek kullanımlık bıçak takın. Her zaman bıçağın temiz bir parçasını kullanmaya çalışın.
- Donmuş otopsi beyinlerini, az miktarda optimal kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği (sahnenin merkezi alanını kaplamaya yetecek kadar; Malzeme Tablosuna bakınız) ile birlikte sahneye koyun.
- İnce kesit alma koşullarını seçin. IMS için, insan beyni bölümleri için 10-12 μm kalınlık kullanın. IMS ve immünohistokimya (IHC) için, her doku örneğinden beş ila altı bölüm kesin.
- Bıçak dokuyu kesmeye yeni başladığında, tekerleği çevirin ve tüm doku açığa çıkana kadar bloğa "bakın". Kesit boyunca küçük bir çizgi veya yırtılma varsa, sıcaklık ayarı otomatik olarak düzeltene kadar kriyostatta biraz daha bekleyin. Altında bir mendil bulunan anti-roll'u açmadan önce birkaç saniye sayın.
- Kağıt mendil dilimini hemen cam sürgünün ITO kaplı tarafına yerleştirin. ITO kaplı olmayan taraftaki sürgünün altına bir parmağınızı koyarak doku dilimini çözün. Doku slayta yapışacaktır; Dokunun kırışıklık olmadan mümkün olduğunca düz olduğundan emin olun. Bu adımı oda sıcaklığında gerçekleştirin.
not: Eldiven, maske ve laboratuvar önlüğü giyin çünkü insan numuneleri biyolojik kirleticiler içerebilir. Gün için tüm bölümler yapıldığında, kriyostatı, fırçaları ve aynaları laboratuvar bezleri ve 200 mL %100 etanol ile temizleyin.
- Doku bölümlerinin durulanması
- Endojen lipitleri ve inorganik tuzları uzaklaştırmak için numuneleri 30 saniye boyunca 40-100 mL %70 etanole daldırın. Bir cam boyama kavanozu kullanın.
- Numuneleri 30 saniye boyunca 40-100 mL %100 etanol, 3 dakika boyunca 40-100 mL Carnoy çözeltisi, 30 saniye boyunca 40-100 mL %100 etanol, 40-100 mL %0.1 trifloroasetik asit (TFA) 1 dakika ve 30 saniye boyunca 40-100 mL %100 etanol. Bir cam boyama kavanozu kullanın.
not: Carnoy'un çözeltisi, altı kısım etanol, üç kısım asetik asit ve bir kısım kloroformdan oluşan bir fiksatiftir.
- 30 dakika vakumda kurutun.
- Otopsi beyin dokularından Aβ proteinlerinin daha iyi iyonizasyonu için doku bölümlerinin formik asit buharı ile tedavisi
- 5 mL %100 formik asit ile sonraki buharlaştırma için kullanılacak fırını ve inkübasyon cam sürgüsünü hazırlayın. Tatmin edici bir asit muamelesi elde etmek için, inkübasyon cam kabındaki hava nemini bu adım boyunca doygunluk seviyesinde tutun ve sıcaklığı 60 °C'de tutun. Formik aside daldırılmasını önleyerek doku slaytlarını inkübasyon cam kabına yerleştirin ve 6 dakika boyunca tedavi edin.
- Bir film tarayıcı, jel tarayıcı veya dijital mikroskop vb. kullanarak numunelerin optik görüntüsünü alın. Bu adımı oda sıcaklığında gerçekleştirin. Numunelerin optik görüntüsünün hizalanması, numune hedefi cihazın içine yerleştirildiğinde gereklidir. Genellikle, matris tabakasının altındaki doku bölümünü tanımak mümkün olmayacaktır.
NOT: Optik görüntü almanın en uygun yolu bir ofis tarayıcısı kullanmaktır. Görüntüyü görüntüleme veri depolama klasörüne kaydetmek iyi bir fikirdir.
- Optik görüntüleri örneklerle ilişkilendirmek için, hem optik görüntüde hem de kamera optiğindeki matris katmanının altında görünen kılavuz işaretleri yapın. En kolay yol, optik görüntüyü çekmeden önce numunenin etrafında en az üç düzeltme sıvısı işareti tespit etmektir.
- Matris uygulaması
- Matris çözeltisinin hazırlanması
- Organik solvente toleranslı bir mikrotüpte,% 50 asetonitril (ACN) ve% 0.1 TFA içinde 10 mg / mL sinapinik asit (SA) çözeltisi hazırlayın. SA bileşiğini 10 dakika boyunca girdap veya kısa sonikasyon ile iyice çözün. Solüsyonu kullanılana kadar oda sıcaklığında saklayın.
NOT: Matris püskürtme için üç farklı seçenek vardır: airbrush, ultrasonik püskürtücü veya otomatik püskürtücü kullanarak.
- Matrisin bir airbrush ile püskürtülmesi
- İşlemi sabit bir oda sıcaklığında (20–23 °C) ve nemde (%40–%60) gerçekleştirin. Optimum püskürtme için ayarlanacak parametreler arasında damlacığın boyutu, sis miktarı, püskürtme memesi ile doku bölümü arasındaki açı ve mesafe ve laboratuvar sıcaklığı ve nemi yer alır. Mikroskopi sonuçlarını kontrol ederek bu koşulları ayarlayın.
not: Sınırlayıcı faktörler arasında kristal boyutu ve matris kapsamının homojenliği ve analitlerin istenmeyen göçü/difüzyonu yer aldığından, damla boyutu için daha küçük olması daha iyidir. Homojenlik aynı zamanda kontrol noktasıdır.
- Matrisin ultrasonik püskürtücü ile püskürtülmesi
- Püskürtülecek dokuyu desikatörden çıkarın ve hazneye yerleştirin. Dokunun sensör penceresini kapatmadığından emin olun.
- Başlat düğmesine basarak hazırlığa başlayın; genellikle, hazırlık süresi yaklaşık 90 dakikadır. Hazırlık, matris tabakası kalınlığının ve ıslaklığının izlenmesi yoluyla otomatik olarak düzenlenecektir. Hazırlık tamamlandıktan sonra, slaytı çıkarın ve MALDI cihazında okumadan önce 15 dakika kurutucuda saklayın.
- Püskürtücüyü, püskürtme kafası temiz görünene kadar 2–3 mL %100 metanol (MeOH) ile temizleyin.
not: İnce bir matris damlacıkları sisinin, yerçekimi tabakası ile dokuya batmasına izin verilir. Ortalama 20 μm'lik bir damlacık boyutu üretilir; Tüm damlacık çapları 50 μm'den azdır.
- Matrisin otomatik bir püskürtücü ile püskürtülmesi
- Matris solüsyonunu otomatik bir püskürtücü ile doku yüzeyine püskürtün. Sabit bir ısıtılmış kılıf gazı akışı (N2, 10 psi ve 75 °C'ye ayarlanmış) matris çözeltisi spreyi ile birlikte verilecektir. Matris çözeltisini sağlamak için bir solvent pompa sistemi (10 psi ve 0.15 mL/dk olarak ayarlanmış) kullanın.
not: En önemlisi, matris aerosollerinin solunmasını önlemek için bir güvenlik kabini altında çalışın. Homojen matris kristalizasyonunu yeniden üretmek için oda sıcaklığını ve nemini kontrol edin.
2. MALDI-IMS
- Ultra yüksek hızlı kütle spektrometresi gerçekleştirin.
- 10 kHz neodimyum katkılı itriyum alüminyum granat (Nd:YAG, 355 nm) lazer ile donatılmış MALDI-IMS ile yüksek verimli ve yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleme deneyleri gerçekleştirin.
- Kütle spektrometresi ölçümleri için, MALDI kontrol yazılımını ve veri analiz yazılımını kullanarak doku alanlarını tanımlayın.
- 2.000–20.000 m/z kütle aralığı ve 20 ve 100 μm uzamsal çözünürlüğe sahip pozitif doğrusal modda spektrumlar elde edin.
- Kalibrasyon standardını yapmak için, peptit kalibrasyon standardını ve protein kalibrasyon standardını TA30 çözeltisinde (ACN:% 0.1 TFA = 30: 70) alfa-Siyano-4-hidroksil-sinnamik asit (CHCA) ile 1: 4 oranında çözün ve ardından 10x seyreltin. 1 μL kalibrasyon standardını slayta dört farklı konuma yerleştirin.
- Moleküler histoloji yazılımını kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), yaşlılık plaklarında (SP'ler) ve arteriyel duvarlarda birlikte lokalize olan farklı Aβ peptitleri gibi çeşitli sinyallerin uzamsal korelasyonunu bulmak için birden fazla tek görüntüyü üst üste bindirin.
