Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Malzemeler
- Lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonunun hazırlanması
- Salmonella typhimurium'dan türetilen 25 mg LPS tozuna 25 mL damıtılmış su ekleyin ve 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Enjeksiyonu 4 °C.
'de steril bir tüpte saklayın
Dikkat: LPS toksiktir.
- EB enjeksiyonunu çalışma konsantrasyonunda tutmak için normal% 0.9 salin çözeltisinde% 2'lik bir Evans mavisi (EB) çözeltisi hazırlayın.
2. Hayvanlar
LPS'yi 10 haftalık (ortalama ağırlık: 280 ± 20 g) erkek Sprague-Dawley (SD) sıçanlarına intraperitoneal enjeksiyonla uygulayın.
Dikkat: Sıçanlar başka bir kuruluştan satın alınırsa, adaptif faz 7 günden az olmamalıdır.
3. LPS Enjeksiyonları
- LPS'yi her bir sıçana 1 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal olarak enjekte edin ve sıçanları ev kafeslerine geri koyun.
not: Anestezi gerekli değildir.
- Altı saat sonra, sıçanlara aynı dozda LPS enjeksiyonu enjekte edin.
- On altı saat sonra aynı dozda LPS'yi sıçanlara enjekte edin.
Dikkat: SD sıçanlara 1 mg / kg'lık bir dozda LPS enjekte etmek% 5'lik bir mortalite oranı ile sonuçlanabilir. Ölüm oranı, genç veya yaşlı sıçanlarda veya hamile dişi sıçanlarda daha da artabilir.
- LPS enjeksiyonundan sonra fareleri kafeslerine geri koyun ve yiyecek ve içeceklere ad libitum erişim sağlayın.
not: Sıçanlar belirgin bir sistemik enflamatuar yanıt sergileyecektir ve bu nedenle kafeslerin deney boyunca temiz kalması esastır. Sıçanlar, ilk LPS enjeksiyonundan sonra kilo, genel görünüm ve tutum için sık sık (2x gün) izlenmelidir. Sıçanlar kambur bir duruş, hareket etme isteksizliği, önemli kilo kaybı (% >20), porfirin lekelenmesi sergilemeye başlarsa, 7 günlük EB çalışmasının bitiş noktasından önce insanca ötenazi yapılmaları gerekir.
4. Örnek Toplama
- EB enjeksiyonu
- İlk enjeksiyondan yedi gün sonra, onaylanmış IACUC protokolünüze göre fareyi intraperitoneal olarak uyuşturun.
- Sıçanlar kornea refleks tepkileri göstermeyene kadar 1-2 dakika bekleyin. Her sıçan üzerinde 5-8 mm derinliğinde bir kardiyak ponksiyon yapın; Delinme noktası, 3. ve 4. interkostal boşlukta sternumun sol kenarına 5 mm olmalıdır.
- Kan iyileşmesi gözlenene kadar bekleyin ve ardından sol kalp ventrikülüne 0.2 mL / 100 g vücut ağırlığı dozunda EB enjekte edin.
Dikkat: Kardiyak ponksiyon ve EB enjeksiyonu dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. EB sol kalp ventrikülü yerine toraks boşluğuna veya perikard içine enjekte edilebilir.
- Boş bir tüp ile geri emdirin ve başarısızlık oranını azaltmaya yardımcı olmak için enjeksiyondan önce bu hacmi bir EB tüpü ile değiştirin (örneğin, yanlışlıkla göğüs kafesine enjeksiyon).
- Fareyi 10 dakika sırtüstü pozisyonda tutun
NOT: İmmünofloresan görüntülemede EB sızıntısını tespit etmek için numune kullanılmazsa, bu adım atlanabilir.
- Brüt gözlem
- Serebral vaskülatürü ve beyinleri temizlemek için buz gibi 1 M fosfat tampon salin (PBS) kullanarak kardiyak perfüzyonlar yapın.
- Bir neşter kullanarak, diyaframın tüm uzunluğu boyunca abdominal bir kesi yapın.
- Göğüs kafesinin orta hattının hemen solundaki kaburgaları kesin.
- Göğüs boşluğunu açın. Kalbi açığa çıkarmak ve kan ve diğer sıvıların drenajını kolaylaştırmak için kelepçeler kullanın.
- Kalbi forseps ile sabit bir şekilde tutarken (kalp hala atıyor olmalıdır), bunu yaklaşık 5 mm'ye uzatmak için doğrudan sol ventrikülün çıkıntısına bir iğne sokun. Giriş noktasının yakınında sıkıştırarak iğneyi bu pozisyonda sabitleyin.
Dikkat: İğneyi aşırı derecede uzatmayın, çünkü iç duvarı delebilir ve çözeltilerin dolaşımını tehlikeye atabilir.
- Buz gibi soğuk PBS çözeltisinin (200-300 mL) bir perfüzyon pompası kullanarak yaklaşık 20 mL / dk'da yavaş ve sabit bir hızda akmasına izin vermek için valfi serbest bırakın. Hayvanlar brüt gözlem yerine fiksasyona ihtiyaç duyuyorsa, aynı dozda buz gibi% 0.9 tuzlu su çözeltisi kullanın.
- Keskin bir makas kullanarak, atriyumda bir kesi yapın ve çözeltinin sürekli akmasını sağlayın. Sıvı serbestçe akmıyorsa veya hayvanın burun deliklerinden veya ağzından geliyorsa, iğneyi yeniden konumlandırın.
- Brüt gözlem ile CMH'ler için ekran.
not: Numune, brüt gözlem yoluyla CMH sayısının hesaplanmasında kullanılmıyorsa, bu adım atlanabilir.
- Fiksasyon
- Serebral vaskülatürü ve beyinleri temizlemek için buz gibi% 0.9 tuzlu su çözeltisi (200-300 mL) kullanarak kardiyak perfüzyon yapın.
- Fiksasyon için buz gibi% 4 paraformaldehit kullanarak kardiyak perfüzyon yapın.
- Sıçanın başını kesin, beyni izole edin ve beyni en az 6 saat boyunca% 20 sükroz çözeltisine batırın.
- Çözeltiyi% 30 sükroz olarak değiştirin ve 6 saat daha sabitleyin.
- Bir kriyostat kullanarak 10 mm kalınlığında beyin dokuları kesitleri hazırlayın.
5. Hematoksilen ve eozin (HE) Boyama
>NOT: Bu prosedür bir HE Boyama Kiti kullanılarak gerçekleştirilir.
- Slaytları damıtılmış suda yıkayın.
- Hematoksilen solüsyonunda 8 dakika lekeleyin. Akan musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
- 30 saniye boyunca% 1 asit alkolde farklılaştırın. Akan musluk suyunda 1 dakika yıkayın.
- % 0.2 amonyaklı su (Bluing) veya doymuş lityum karbonat çözeltisinde 30 s ila 1 dakika boyunca boyayın. Akan musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
- % 95 alkolle durulayın (10 daldırma).
- 30 s ila 1 dakika boyunca eozin solüsyonu ile karşı lekeleyin.
- Her biri 5 dakika boyunca% 95 alkol, iki mutlak alkol değişikliği ile kurutun.
- 30 saniye boyunca ksilen içinde berraklaştırın.
- Liu'nun yöntemini kullanarak monte edin.
- Parlak alan floresan mikroskobu kullanarak analiz edin.
not: CMH'lerin bileşenleri olan kan damarlarından salınan kırmızı kan hücreleri, HE boyaması altında kırmızı-turuncu renkte görünür.
