$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Birincil Hipokampal Hücre Kültürü
- Embriyonik gün 19'da sıçan hipokampusunun ayrışmış hücre kültürünü hazırlayın. Hücreleri, 50.000 - 60.000 hücre / kuyu yoğunluğunda 24 oyuklu tabaklarda polietilenimin (PEI) ile kaplanmış 12 mm'lik lameller üzerine yerleştirin. Bir hücre sayma odası ve faz kontrast optiği kullanarak yoğunluğu kontrol edin.
- Nöronları 3 gün boyunca (gün in vitro (DIV) 3) inkübatörde 24 oyuklu bir plakada 37 ° C'de% 5 CO2 ile kültürleyin.
- İletilen ışık mikroskobu (örneğin, 10 - 20X büyütmede faz kontrast optikleri) kullanarak hücre sağlığı göstergeleri için lamellerin değerlendirilmesi. Aşağıdaki iyi sağlık göstergelerini kontrol edin: berrak bir faz kontrast halesi, boncuklu yapıları olmayan nöritler ve soma kümelenmesi veya nörit demetlenmesi yok.
2. Transfeksiyon
>NOT: Aşağıdaki protokol, 3 kuyu için çift transfeksiyonu ifade eder. Bununla birlikte, protokol 4 kuyu için yeterli miktarlar hazırlandığında en iyi sonucu verir.
- 500 mL transfeksiyon tamponu hazırlayın (274 mM sodyum klorür, NaCl, 10 mM potasyum klorür, KCl, 1.4 mM disodyum hidrojen fosfat,Na2HPO4, 15 mM glikoz, 42 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit, HEPES) bir Erlenmeyer şişesinde.
- Bir Erlenmeyer şişesinde 400 mL damıtılmış suda 8.0 g NaCl, 0.37 g KCl, 0.095 gNa2HPO4, 1.35 g glikoz ve 5.0 g HEPE'yi çözün.
- Bir pH metre kullanarak 1 M sodyum hidroksit, NaOH ile pH'ı 6,95'e ayarlayın.
- Damıtılmış su ile hacmi 500 mL'ye ayarlayın ve bir pH metre kullanarak pH'ı kontrol edin.
- Transfeksiyon tamponuna 1 M NaOH pipetleyerek aşağıdaki pH değerlerine sahip 20 - 30 mL transfeksiyon tamponu alikotu yapın: 6.96, 6.97, 6.98, 6.99, 7.00, 7.01, 7.02, 7.03, 7.04, 7.05, 7.06, 7.07, 7.08, 7.09, 7.11.
NOT: Transfeksiyon tamponunun pH'ı, transfeksiyon etkinliği için çok önemlidir.
- Hangi transfeksiyon tamponunun en fazla transfekte hücre sayısına yol açtığını test etmek için, her pH değerini 6.96 ile 7.11 arasında test edin. 2.2 - 2.11'de açıklanan transfeksiyon yöntemini ve yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden doğrulanmış bir plazmidi kullanın. Hangi tamponun en iyi sonucu verdiğini değerlendirmek için her transfeksiyon tamponu pH değeri için lamel başına transfekte edilen hücre sayısını belirleyin.
- En yüksek transfeksiyon verimliliğine sahip tamponu 2 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın Tüpleri dondurun ve -20 °C'de saklayın.
- İndirgenmiş serum ortamını, hücre kültürü ortamını ve damıtılmış suyu su banyosunda 37 °C'ye önceden ısıtın.
- Transfeksiyon karışımını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde hazırlayın. Steril çalışma koşullarını sağlamak için laminer akış başlığı altında çalışın.
- 7.5 μL 2 M kalsiyum klorürü her biri 4 μg endotoksin içermeyen DNA (Synaptophysin-mOrange ve mGFP/GFP-Rogdi) ile karıştırın. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplam 60 μL hacme ulaşmak için su ekleyin.
- Karışıma 60 μL transfeksiyon tamponu ekleyin. En iyi sonuçları elde etmek için, DNA karışımını girdap üzerinde hafifçe sallarken transfeksiyon tamponunu damla damla ekleyin.
- Oda sıcaklığında (RT) 20 dakika inkübe edin. Tüpü laminer akış başlığının yanına yerleştirerek inkübasyon süresi boyunca inkübasyon tüpünü sallamaktan kaçının.
- Laminer akış başlığının altında, 1000 μL'lik bir pipet kullanarak hücre kültürü ortamını ("şartlandırılmış ortam") kuyucuklardan çıkarın ve inkübatörde ayrı bir kapta saklayın.
- Her oyuğa 500 μL indirgenmiş serum ortamı ekleyin. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'de 20 dakikalık inkübasyon süresi (adım 2.3.3) bitene kadar inkübe edin.
- Birkaç damla pipetleyerek her bir oyuğa 30 μL transfeksiyon karışımı ekleyin. Tüpün altındaki kalıntıyı atın.
- Tüm kuyucuklara transfeksiyon karışımı verildikten sonra, transfeksiyon karışımının ortamda dağılmasını sağlamak için 24 oyuklu plakayı hafifçe sallayın.
- Kuyuları 37 ° C ve% 5 CO2'de 60 dakika inkübe edin.
- Transfeksiyon karışımını çıkarın ve atın ve hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın. Her oyuğa 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve bunları RT'de 30 saniye inkübe edin. 750 μL ortamı çıkarın ve aynı miktarda taze ortam ekleyin. Bunu üç kez tekrarlayın.
NOT: Yıkama adımı kritiktir. Her bir oyuğun ortamı olmadığı süreyi minimumda tutun (yani, iyice çıkarın ve değiştirin) ve yıkama ortamını yavaşça ekleyin.
- Hücre kültürü ortamını çıkarın ve atın ve şartlandırılmış ortamdan 450 μL iyice ekleyin.
- Nöronların inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'den DIV 10'a kadar olgunlaşmasına izin verin.
3. Stimülasyon ve Syt1 Alımı
NOT: Aşağıdaki protokol, alımı 3 kuyuya uygular. Diğer herhangi bir sayıda kuyunun depolarizasyonu için, miktarları buna göre ayarlayın.
- 50 mL 10x depolarizasyon tamponu (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM magnezyum klorür, MgCl2, 20 mM kalsiyum klorür, CaCl2, 300 mM glikoz, 200 mM HEPES, pH 7.4) bir Erlenmeyer şişesinde hazırlayın.
NOT: Depolarizasyon tamponu birkaç hafta boyunca 4 ° C'de tutulabilir. Depolarize olmayan bir çözelti de kullanılıyorsa, stimülasyona bağlı geri dönüşümü kendiliğinden geri dönüşüm ile karşılaştırmak için 1290 mM NaCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM CaCl2, 300 mM Glikoz, 200 mM HEPES pH 7.4'ten oluşan 10x Tyrode çözeltisi hazırlayın. 1x'e seyreltildikten sonra, aksiyon potansiyeli oluşumunu engellemek için kullanmadan önce 1 μM Tetrodotoksin ekleyin.
- 1.87 g NaCl, 2.61 g KCl, 0.1 g MgCl2-6H 2O, 0.15 g CaCl 2-2H2Ove 3.0 g glikoz-1 H 2O ve 2.38 g HEPE'yi 50 mL damıtılmış suda çözün. PH'ı NaOH ile ayarlayın ve çözeltiyi steril olarak filtreleyin. 1x konsantrasyon elde etmek için tamponu 1:10 oranında damıtılmış su ile seyreltin.
- Stimülasyondan sonra fiksasyon için 1x fosfat tamponlu salin (PBS) (pH 7.4) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
- 1x PBS'de 500 mL %4 PFA için, 20 g paraformaldehiti 450 mL damıtılmış H2O içinde çözün.
NOT: Çözeltinin ısıtılması çözünmeyi hızlandırabilir, ancak PFA parçalanabileceğinden çözeltiyi 70 °C'nin üzerinde ısıtmayın.
Dikkat: PFA toksik, potansiyel olarak kanserojen ve teratojeniktir. PFA ile çalışırken eldiven giyin, çeker ocak altında çalışın ve yutmaktan kaçının.
- Çözeltiyi RT'ye soğumaya bırakın ve 50 mL 10x PBS stok çözeltisi ekleyin. Bir pH metre kullanarak NaOH / HCl (hidroklorik asit) ile pH'ı 7.4'e ayarlayın.
- Su banyosunda 600 μL 1x depolarizasyon tamponu ve 10 mL hücre kültürü ortamını 37 ° C'ye önceden ısıtın.
- 1x depolarizasyon tamponuna 1 μL fare anti-Syt1 antikoru (klon 604.2) ekleyin ve 10 saniye boyunca girdap yapın.
- Hücre kültürü ortamını hücrelerden çıkarın ve atın. Her bir oyuğa 200 μL depolarizasyon-antikor karışımı ekleyin ve inkübatörde 37 ° C ve% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin.
- Depolarizasyon-antikor karışımını çıkarın ve atın ve hücre kültürü ortamı ile üç kez yıkayın. Her oyuğa 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve RT'de 30 saniye inkübe edin. 750 μL ortamı çıkarın ve aynı miktarda taze ortam ekleyin. Üç kez tekrarlayın.
- Hücre kültürü ortamını çıkarın ve atın ve 1x PBS'ye 300 μL% 4 PFA ekleyin. 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
- Her biri 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
4. İmmünositokimya
- 50 mL blokaj tamponu hazırlayın.
NOT: Blokaj tamponu birkaç ay boyunca -20 ° C'de tutulabilir.
- 2.5 g sükroz ve 1 g sığır serum albüminini (BSA) 5 mL 10x PBS stok çözeltisinde çözün. 1,5 mL% 10 deterjan stok çözeltisi ekleyin. Tüm bileşenler düzgün bir şekilde çözülene kadar çözeltiyi karıştırın ve 50 mL'lik bir nihai hacme ulaşana kadar damıtılmışH2Oekleyin. Çözeltiyi ayırın ve alikotları saklamak için dondurun.
- İkincil, floroforla birleştirilmiş antikoru (birincil Syt1-antikor türlerine karşı yönlendirilmiş) her bir oyukta 200 μL bloke edici tampon içinde 1:1000'lik bir seyreltmeyle seyreltin.
- Bir lamel içeren her kuyucuktan 1x PBS'yi çıkarın ve atın.
- Her oyuğa 200 μL bloke edici tampon-antikor karışımı ekleyin ve RT'de 60 dakika inkübe edin.
Dikkat: İkincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, ileriye doğru hareket eden tüm adımlar karanlıkta gerçekleştirilmelidir.
- İnkübasyondan sonra, hücreleri 1 mL 1x PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Lamelleri, gömme ortamı ile mikroskop slaytlarına gömün.
- Mikroskop lamına 7 μL'lik bir damla gömme ortamı ekleyin. Lameli bir şırınga ile kaldırarak ve forseps ile tutarak 24 oyuklu plakadan çıkarın.
Dikkat: Lamelin yüzeyindeki hücreler kolayca zarar görebilir, bu nedenle forsepsler dikkatli kullanılmalıdır.
- PBS'yi çıkarmak için lameli damıtılmış suya batırın ve bir kenarını yumuşak dokuya değdirerek dikkatlice kurulayın.
- Lameli gömme ortam damlacığının üzerine çevirin, böylece hücreleri taşıyan yüzey mikroskop slaytına bakar, böylece hücreleri gömme ortamına gömer.
- Slaytları kaputun altında 1-2 saat kurumaya bırakın (ışığa maruz kalmamak için üzerlerini örtün) ve 4 °C.
'de bir mikroskop slayt kutusunda saklayın
NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.