Alfa-Sinüklein Agregatları ile Tedavi Edilen Nöronların İmmün Boyanması

Özet

Kaynak: Panattoni, G., et al. Fibril Oluşumunun Güçlü Bir Hücre Modeli Olarak Mikrozomlarla İlişkili Alfa-sinüklein Agregatlarının Primer Nöronlara Eksojen Uygulaması. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, alfa-sinüklein (αS) agregatları ile tedavi edilen nöronların immün boyamayı göstermektedir. Nöronlar ilk olarak αS agregatları ile muamele edilir. Daha sonra sabitlenir, geçirgen hale getirilir ve bir bloke edici çözelti ile muamele edilir. Birincil antikorlar eklenir, ardından floresan olarak işaretlenmiş bir ikincil antikorlar ve bir nükleer leke gelir. Numune daha sonra monte edilir ve mikroskop altında gözlemlenir.

Protokol

1. Nöron Tedavisi

Not: Tedavi Bölüm (DIV) 7'de gerçekleştirilmiştir. Tüm aşamalar steril koşullarda bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleştirilir. DIV 7'deki kortikal nöronal kültür yoğunluğunun bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Orijinal homojenizasyon tamponu [250 mM sükroz, 20 mM HEPES (4- (2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asitten oluşur], 10 mM KCl (Potasyum Klorür), 1.5 mM MgCl₂ ( (Magnezyum Klorür), 2 mM EDTA (Etilendiamintetraasetik asit), ve seyreltme için 1x fosfataz / proteaz inhibitörleri].
2. Orta (% 2 B27, 10x gentamisin ve 2 mM glutamin) içeren 24 oyuklu plakalarda poli-D-Lizin lameller üzerinde bir nöron kültürü alın. Ortamın 1 / 3'ünü çıkarın ve% 2 B27, 1x gentamisin ve 2 mM glutamin içeren taze ortamla nazikçe değiştirin.
3. Hücre ortamına 1 μg havuzlanmış mikrozomlarla ilişkili alfa-sinüklein (αS) agregaları ekleyin. Nöronları 37 ° C'de inkübatöre geri koyun.
4. 1 hafta boyunca her 3 günde bir, 1 / 3 taze ortam ekleyin. Ortamı değiştirmeyin. Sadece ekleyin.
5. 1 haftalık tedaviden sonra, ortamın 1 / 3'ünü çıkarın ve% 2 B27, 10 μg / mL gentamisin ve 2 mM glutamin içeren taze ortamla nazikçe değiştirin. Her 3 günde bir tekrarlayın.
6. 2 haftalık tedaviden sonra nöronları düzeltin (DIV 21).

2. İmmünofloresan

1. Nöronları Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 1x ve %5 sükroz çözeltisi içinde %2 paraformaldehit ile oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca kimyasal bir çeker ocak altında çalkalamadan sabitleyin.
2. Sabitleme solüsyonunu çıkarın. PBS 1x ile 3 kez kısa bir süre yıkayın.
   not: Tüm yıkama adımlarını nazikçe gerçekleştirin çünkü birincil nöronlar poli-lizin lamellerine sıkıca yapışmaz.
3. RT'de 5 dakika boyunca PBS 1x'te% 0.3 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile nöronları geçirgenleştirin.
4. Kısa bir süre PBS ile 1x, 3 kez yıkayın.
Bir
5. orbital çalkalayıcı üzerindeki spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için nöronları RT'de 30 dakika boyunca PBS 1x'te% 3 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile inkübe edin.
6. Bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de PBS 1x, O/N içinde% 3 FBS içinde çözünmüş uygun primer antikor ile nöronları inkübe edin.
   NOT: syn303 (1:1,000), fare αS (1:200), pser129-αS (1:1,000) ve Tau (1:10,000) antikorları kullanıldı.
7. Antikor solüsyonunu çıkarın ve kısa bir süre PBS 1x ile 3 kez yıkayın.
8. Nöronları, karanlıkta RT'de 1 saat boyunca PBS'de% 3 FBS'de çözünmüş uygun floresan ikincil antikor ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
9. Antikor solüsyonunu çıkarın ve kısa bir süre PBS 1x ile 3 kez yıkayın.
10. Nöronları DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenilindol) çözeltisi (PBS 1x'te 0.1 μg / mL) ile karanlıkta karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcıda boyayın.
11. Antikor solüsyonunu çıkarın ve kısa bir süre PBS 1x ile 3 kez yıkayın.
12. Lamelleri bir antifade montaj ortamı kullanarak bir slayt üzerine monte edin.

Sonuçlar

Şekil 1. Kortikal nöronal kültürler. Kortikal nöronal kültürlerin DIV 7'deki yoğunluğu gösteren temsili görüntü. Görüntüler ters çevrilmiş ışık mikroskobu, 10X objektif ile çekildi. Ölçek çubuğu = 100 μm.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sakaroz	Sigma-Aldrich	84097-1KG
Hepes Belediyesi	Sigma-Aldrich	H0887-100ML	1M pH = 7-7.6
Edta	Sigma-Aldrich	0390-100ml	pH = 8 0.5M
Magnezyum klorür	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Sodyum karbonat	Sigma-Aldrich	S7795-500G
Sodyum bikarbonat	Sigma-Aldrich	S5761-500G
metanol	Sigma-Aldrich	322415-6X1L
Kartal	Sigma-Aldrich	P9541-500G
cOmplete Mini	Roche	11836170001	proteaz inhibitörü
Fos Durdurucu	Roche	4906837001	fosfataz inhibitörü
BCA Protein Test Kiti	Euroclone (Avrupa Klonu	EMPO14500
Criterion TGX %4-20 Lekesiz, 18 kuyu	Biyorad	5678094
Desteklenen Nitroselüloz membran	Biyorad	1620097	0,2 μm
Lekelenme Sınıfı Engelleyici	Biyorad	1706404	Yağsız kuru süt
SuperSignal West Pico Kemilüminesan Yüzey	Termo Fisher Bilimsel	34077
Nitrik asit	Sigma-Aldrich	1004411000	%65
Cam lameller	Termo Fisher Bilimsel	1014355118NR1	18 mm x
Poli-D-Lizin	Sigma-Aldrich	P7280 Serisi
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi	Termo Fisher Bilimsel	14170-500 mL
Penisilin / Streptomisin	Termo Fisher Bilimsel	15140122	10.000 U/mL, 100 mL
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı	Termo Fisher Bilimsel	D5796-500 mL
Tripsin-EDTA	Termo Fisher Bilimsel	15400054	%0,50
B27 Takviyesi	Termo Fisher Bilimsel	17504044	50 katı
Glutamax (Glutamaks)	Termo Fisher Bilimsel	35050-038	100 katı
DNAse	Sigma-Aldrich	D5025
Fetal sığır serumu	Euroclone (Avrupa Klonu	EC50182L
Glutamat	Sigma-Aldrich	1446600-1G
Gentamisin	Termo Fisher Bilimsel	15710	10 mg / ml
Nörobazal Orta	Termo Fisher Bilimsel	10888-022
Sitozin arabinozit (AraC)	Sigma-Aldrich	C3350000
VECTASHIELD antifade montaj ortamı	Vektör Laboratuvarları	H-1000
DAPI (DAPI	Termo Fisher Bilimsel	62247
90 Ti rotor	Beckman	Yok	Ultrasantrifüj rotoru
Optima L-90K Ultrasantrifüj	Beckman	Yok
Syn-1 antikoru, klon 42	BD Biyolojik Bilimler	610786	anti-fare WB: 1:5000
Syn303 antikoru	Biyo Efsane	824301	anti-fare IF: 1:1000
Tau antikoru	Sinaptik Sistemler	314 002	tavşan karşıtı IF: 1:10.000
pser129-αS antikoru	Fujiwara ve ark.'dan bir hediye, referans 19		tavşan karşıtı WB: 1:5000
pser129-αS antikoru	Abcam Belediyesi	AB51253	tavşan önleyici IF: 1:1000
Fare αS (D37A6) XP	Hücre Sinyalizasyonu	4179	anti-tavşan EĞER 1:200
Alexa fluor 555-konjuge anti-tavşan antikoru	Termo Fisher Bilimsel	A27039
Alexa fluor 488-konjuge anti-fare antikoru	Termo Fisher Bilimsel	A-11029
Mikro Oğul XL-2000	Misonix (Misrik)		Ses Seviyesi
Ultra Şişeler (Oakridge Şişeler), PCB, 16x76mm, Montaj, Noryl Kapak, Beckman tipi	Bilim Servisi AB	S4484 Serisi	Ultrasantrifüj tüpleri
AXIO Gözlemci Ters Işık Mikroskobu	Zeiss	Yok
TCS SP2 lazer taramalı konfokal mikroskop	Leica Belediyesi	Yok
Ters epi-floresan mikroskobu	Nikon	Yok
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-500ML	Noniyonik yüzey aktif madde

Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi ) Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi ) Gazetesi Gazetesi Serisi ) (İngilizce) Serisi Serisi Gazetesi