İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronlarda İn Vitro Gerilme Yaralanması Modeli

Özet

Kaynak: Phillips, J. K. et al. 96 Kuyucuklu Formatta İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türetilmiş Nöronların Yüksek Hızlı Gerilme Yaralanması Yöntemi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronlarda (hiPSCN'ler) gerilme yaralanmasını indükleme sürecini göstermektedir. Hücreler, silikon bir zar takılı dipsiz, çok kuyulu bir plakaya alınır. Hücre iskeleti bozulmasını ve hücre zarı hasarını indüklemek için zar üzerine kontrollü mekanik stres uygulanır ve hücrelerde gerilme yaralanması fenotipine neden olur.

Protokol

1. Plaka İmalatı

1. 96 oyuklu bir plakanın üst kısmını 200 W'lık bir plazma temizleyici ile (Malzeme Tablosuna bakın) 60 saniye boyunca yüksek güçte plazma işlemine tabi tutun ve alt tarafı yukarı bakacak şekilde plazma temizleyicinin içine yerleştirin. Odanın penceresinden görünen mor bir parıltı olup olmadığını kontrol edin, bu da etkili bir plazmanın oluştuğunu gösterir. Bu yapıştırma tekniği Sunkara ve ark.'dan uyarlanmıştır.
2. 60 saniye içinde, plaka üstünü 200 mL %1.5 (3-Aminopropil) trietoksisilan (APTES) içinde deiyonize (DI) suya 20 dakika boyunca alt tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Bu çözüm kararsızdır: plakayı yerleştirmeden önce en fazla 60 saniye hazırlayın.
   Dikkat: Çeker ocakta APTES ile çalışın.
3. Plazma, ekstrakte edilmiş bir silikon membranı plazma temizleyicide 60 saniye boyunca yüksek güçte işlemden geçirir. Plazma tedavisini, adım 1.2'deki 20 dakikalık sürenin bitiminden en fazla 5 dakika önce bitecek şekilde zamanlayın.
4. Plazma ile muamele edilmiş zarı 7,5 x 11^cm2 parşömen kağıdı dikdörtgeninin üzerine yerleştirmek için forseps kullanın. 7.5 cm x 11 cm x 0.5 cm'lik bir alüminyum levhayı plaka imalat kelepçesinin alt kısmına hizalayın. Silikon zarı ve parşömen kağıdını forseps kullanarak alüminyum levha üzerine hizalayın.
5. Plaka üstlerini APTES banyosundan çıkarın ve fazla çözeltiyi silkeleyin. 5 saniye boyunca 200 mL DI su banyosuna daldırın ve fazla suyu silkeleyin. 5 saniye boyunca farklı bir 200 mL DI su banyosuna daldırın ve fazla suyu silkeleyin. Başka bir tabağın üstüne daldırmadan önce bu banyolardaki suyu değiştirin.
6. Plakanın üst kısmını tamamen kurutmak için basınçlı hava kullanın.
7. Plaka üst kısmını, plaka imalat kelepçesinin üst kısmına yerleştirin. Plaka üstünü ve silikonu birbirine bastırmak için plaka imalat kelepçesini yavaşça kapatın. En az 1 saat kelepçeleyin.
8. Kullanmadan önce plakanın oda sıcaklığında 24 saat kürlenmesini bekleyin, tozdan koruyun.

2. Bir Plakayı Germek

1. Girintileri temizleyin
   1. Oda sıcaklığında DI su ile 60 W'lık banyo tarzı bir sonikatör hazırlayın.
   2. Sonikatör banyosunun üzerindeki girinti bloğunu, yalnızca girintilerin üst kısımları en az 1 mm derinliğe batırılacak şekilde ters çevrilerek destekleyin. Girintileri 42 kHz'de 8 dakika boyunca sonikleştirin.
   3. Girintileri basınçlı hava ile kurutun.
2. Girinti bloğunu hizalama
   1. Canlı yayını olan bir kamerayı, girinti dizisine aşağı bakacak şekilde germe cihazının üzerine yerleştirin. Girintilerin üst kısımlarına odaklanın.
      not: Bölüm 3, "Membran Esnemesini Karakterize Etme" bölümünde açıklanan kurulum, bu görev için olası bir kamera kurulumudur.
   2. Stage cl'ye bir plaka sabitleyintag'ı kullanarak yaralanma cihazınınamps (Şekil 1) ve cihazın üzerine bir kubbe ışığı yerleştirin.
      not: Cihaz kontrol yazılımı için Malzeme Tablosuna bakın.
   3. Yaralanma cihazını kontrol eden bilgisayarın masaüstündeki yazılım simgesine tıklayarak cihaz kontrol yazılımını başlatın. Başlatma penceresinde üzerine tıklayarak "in_vitro_neurotrauma.lvproj" projesini çalıştırın. Proje penceresinden, üzerlerine çift tıklayarak sırasıyla 'motion_control.vi' ve 'position_tracker.vi' olarak adlandırılan hareket kontrolü ve konum izleyici sanal cihazlarını (VI'lar) başlatın.
   4. Yaralanma cihazını çevreleyen kafesi kapatın. VI'yı çalıştırmak için hareket kontrolü VI'nın sol üst köşesindeki 'ok' düğmesine basın ve s'yi düşürmek için 'Alta Yakın'a tıklayın.tage girintilere temas ettikten sonra 2 mm içinde. VI.
      Dikkat: Kafesteki kamerayı manipüle ederken ellerinizi sedyeden uzak tutun. Kafes, yalnızca kafes kapısı kapalıyken germe cihazına güç sağlayan bir kapı anahtarı ile donatılmalıdır.
   5. Proje penceresinde 'Eksen 1'e sağ tıklayın. 'İnteraktif Test Paneli'ne tıklayın. Açılan pencerede, 'Hedef Konum' alanına '500' birim girerek adım boyutunu 50 μm olarak ayarlayın.
   6. 'Etkileşimli Test Paneli' penceresinin altındaki yeşil 'git' düğmesini, plaka herhangi bir girinti ile ilk temas edene kadar art arda tıklayın. Kamera tarafından görüntülenen canlı görüntüde temas olup olmadığını kontrol edin. 'Etkileşimli Test Paneli' penceresinin sol üst köşesinde bildirilen dikey sahne konumuna dikkat edin; Bu ilk temas pozisyonudur.
   7. Her kuyucuk girintilerle temas edene kadar daha da indirin (adım 2.2.6'da açıklandığı gibi). Gerekirse, plakanın tamamını görmek için kamerayı hareket ettirin ve sahneyi yukarı (negatif bir 'Hedef Konum' belirterek) yukarı ve aşağı hareket ettirin. Tüm direkler temas halindeyken pencerenin sol üst köşesinde bildirilen dikey aşama konumuna dikkat edin (bu tam temas konumudur).
   8. İlk temas ve tam temas konumları arasındaki farka dikkat edin. 'Etkileşimli Test Paneli'ni kapatın. 'Hareket kontrolü VI'yı çalıştırın (bkz. adım 2.2.4) ve sahneyi yükseltmek için 'Üst'e tıklayın. 'Durdur' düğmesi ile hareket kontrolü VI'yı durdurun.
   9. Sahne alanı hareketinin en üstüne geldiğinde, cihazı devre dışı bırakmak için kapıyı açın. Girinti bloğunun köşelerindeki ayar vidalarını ayarlayın. İlk temas eden köşedeki ayar vidasını gevşetin, indirmek için ve en son temas eden köşeyi kaldırmak için karşı vidayı sıkın.
   10. Plaka girintilere temas edene kadar tablayı indirme işlemini tekrarlayın, temas görüntülerinde eğim olup olmadığını kontrol edin, tablayı kaldırın ve girinti bloğunu ayarlayın (adım 2.2.9). Sahne alanı ve blok hizalandığında, tüm girintiler aynı anda temas kuracaktır.
   11. Cihazı devre dışı bırakmak için kapıyı açın. Bağlama vidalarını girinti bloğundaki deliklerine yerleştirin ve sıkın. Bağlantı vidaları yerindeyken bloğun düz olduğundan emin olun (adım 2.2.4-2.2.8). Plaka temas ettiğinde 'İnteraktif Test Paneli' tarafından bildirilen sahne konumuna dikkat edin. Bu, girinti deneyleri için sıfır konumu olacaktır.
3. Girintileri yağlayın
   1. Girinti bloğu yeni kurulmuşsa ve henüz yağlanmamışsa, katı bir lastik pedi (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) ve yumuşak, kapalı hücreli bir köpük lastik pedi (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) etanole batırılmış laboratuvar bezi ile temizleyin. Havada kurumaya bırakın.
   2. Bir laboratuvar mendilini mısır yağına batırın ve donuk bir parlaklık elde edene kadar katı lastik pedin üzerine yayın.
   3. Yağı köpük pede aktarmak için köpük pedi katı lastik pedin üzerine yerleştirin. Köpük pedin üzerine 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm'lik bir alüminyum levha yerleştirin ve yağın katı lastik pedden köpük ped'e tutarlı bir şekilde aktarılmasını sağlamak için yaklaşık 360 g'lık bir balast ağırlığı (örneğin, her biri 45 mL su ile yüklenmiş 6 konik tüp) yükleyin. Yağın köpük lastik pede geçmesi için 10 saniye bekleyin.
   4. Köpük lastik pedi girinti dizisinin üzerine hareket ettirin. Yağın girintilerin uçlarına tutarlı bir şekilde aktarılmasını sağlamak için alüminyum levhayı ve balast ağırlığını üzerine yerleştirin. Yağın girintilere geçmesi için 10 saniye bekleyin.
   5. Girinti bloğu ilk kez kurulduğundan ve yağlandığından beri herhangi bir plaka gerilmediyse, deneye başlamadan önce bir test plakası gerin. Not: Bu, ilk uzatma ile sonraki uzatmalar arasındaki herhangi bir tutarsızlığın deneyi karıştırmasını önleyecektir. Sonraki esnemeler için, her esnemeden önce yalnızca 2.3.2-2.3.5 adımlarını tekrarlayın.
4. Bir tabak gerin
   1. Girintileri adım 2.3'te açıklandığı gibi yağlayın.
   2. Plakayı, sahne cl ile yaralanma cihazının üzerine sabitleyinamps. Sterilite gerekiyorsa, kültür yüzeyini oda havasına maruz bırakmadan plakayı sabitlemek için kapağın konumunu ayarlayın.
   3. 'Hareket kontrolü VI'yı kullanarak sahneyi sıfır konumuna indirin (bkz. adım 2.2.4-2.2.6); sıfır konumu adım 2.2 sırasında belirlenir.
   4. 'Konum izleme VI'daki "dosya yolu" alanındaki dosya adını benzersiz bir dosya adıyla değiştirin, ardından o pencerenin sol üst köşesindeki 'ok' düğmesiyle çalıştırın.
   5. 'Hareket kontrol paneli VI'daki 'Yaralanma (mm)' ve 'Yaralanma Süresi (ms)' alanlarında girinti derinliğini ve süresini (tipik olarak sırasıyla 1-4 mm ve 30 ms, maksimum derinlik 5 mm, minimum süre 15 ms) ayarlayın.
   6. 'Hareket kontrol paneli VI'yı çalıştırın ve plakayı girintilemek için 'Yarala'ya tıklayın.
   7. 'Üst'e tıklayarak sahneyi hareketinin en üstüne taşıyın. Ardından VI'yı 'Durdur' düğmesiyle durdurun ve kapıyı açarak yaralanma cihazını devre dışı bırakın.
   8. Belirtilen maksimum yer değiştirmenin uygulandığını doğrulamak için 'konum izleyici VI'da sunulan aşamanın yer değiştirme geçmişini inceleyin. Grafiğe sağ tıklayın ve 'Excel'e aktar' seçeneğine tıklayın. 'Dosya| Verileri kaydetmek için Kaydet' düğmesine basın.

3. Membran Gerilmesini Karakterize Etme

1. Yüksek hızlı videografi için yüksek kontrastlı bir arka plan sağlamak üzere her girintinin üst kısmındaki girintiyi beyaza boyayın. Dikkat: Girintilerin plakalarla temas ettikleri yerlerin kenarlarını boyamayın.
2. Poli (laktik asit) (PLA) ile 3D baskı veya başka bir şekilde, her kuyucukta bir nokta yapmak için silindirik bir damga üretin. Silindiri 5,9 mm çapında ve 12,2 mm yüksekliğinde, silindirik çıkıntısı 1,5 mm çapında ve 1,0 mm yüksekliğinde üstte ortalanmış olarak yapın.
3. Plazma, adım 2.1'de belirtildiği gibi, oyuklardaki silikon hücre kültürü yüzeyini 60 saniye boyunca aktive etmek için plakayı sağ tarafı yukarı bakacak şekilde işlemden geçirir.
4. Plakayı lastik bir ped veya başka bir yumuşak yüzey üzerine yerleştirin. Damga üzerindeki küçük çıkıntıyı (bkz. adım 1.2) kalıcı bir keçeli kalemden alınan mürekkeple astarlayın. Damgayı test edilecek kuyuya yerleştirin ve mürekkebin iyi bir şekilde aktarılmasını sağlamak için hafifçe vurun. Damgayı her kuyudan önce astarlayın.
5. Girinti bloğunu hizalayın ve yaralanma cihazının girintilerini yağlayın (bkz. adım 2.2-2.3). Plakayı yaralanma cihazının sahnesine sıkıştırın. Yaralanma cihazının üzerine parlak bir dağınık eksenel ışık yerleştirin.
6. Yaralanma cihazının üzerindeki bom standına, düz aşağı bakacak ve lens en küçük numaralı f-stop'a ayarlanmış olacak şekilde yüksek hızlı bir kamera kurun ve açın. Kameraya bağlı bilgisayarda kamera yazılımını başlatın. Kare hızı açılır menüsünde saniyede 2.000 kare seçin ve deklanşör açılır menüsünde yüksek kontrastlı görüntüler veren en hızlı pozlama süresini seçin. Noktalı kuyuların üzerine ortalayın.
   1. Kamerayı, görüş alanı 3 x 4 ızgarada 12 kuyu içerecek şekilde konumlandırın.
      not: Bu görüş alanı, 1.280 × 1.024 görüntülük bir görüntü için verim ve çözünürlük arasında en iyi uzlaşmayı sağlar.
7. Plakayı sıfır noktasına indirin (bkz. adım 2.2.4-2.2.6). Kamera yazılımındaki kayıt düğmesine bir kez tıklayın, böylece 'tetik girişi' okur. Konum izleyici VI'yı başlatın (adım 2.4.4).
8. Parlak dağınık eksenel ışığı açın. Plakayı adım 2.4.6'da açıklandığı gibi girintileyin.
9. Parlak dağınık eksenel ışığı kapatın.
10. Fotoğraf makinesi kontrol bilgisayarında, girintinin oluştuğu kaydın 30-40 ms'lik penceresini bulun: kamera yazılımındaki yüksek hızlı video oynatma çubuğundaki başlangıç ve bitiş oklarını sürükleyin. Kaydet'e tıklayın, 'Dosya Adı' alanına adı ayarlayın, 'Biçim' alanında 'TIFF'i seçin ve 'Kaydet'e tıklayın.
    1. İnceleyin. En az gerilmiş (başlangıç) ve en gerilmiş (en yüksek girintili) durumların görüntüleri için TIF dosyaları.
    2. Her iki görüntüdeki noktaların yüksekliğini ve genişliğini ölçmek için, en küçük ve en yüksek uzamanın görüntülerini yan yana açmak için Fiji'yi kullanın. Varsayılan dikdörtgen seçim aracını kullanarak, en az uzamış görüntüdeki bir noktanın etrafına bir kutu çizmek için tıklayın ve sürükleyin. 'Analiz| Ölçün'.
    3. Tepe uzama görüntüsündeki aynı kuyucuktaki nokta için tekrarlayın. Kuyuların geri kalanı için tekrarlayın.
11. Lagrange suşunu x ve y yönlerinde aşağıdaki gibi hesaplayın:
    
    not: Burada, E_xx, x yönündeki Lagrange gerilimidir, E_yy, y yönündeki Lagrange gerilimidir, X, noktanın genişliğidir, Y, noktanın yüksekliğidir, _f, son görüntüyü (yani, tepe girinti görüntüsü) ve _i, ilk görüntüyü (yani, ön girinti görüntüsü) belirtir. O kuyudaki gerilimi belirlemek için iki değerin ortalamasını alın.

4. Kültürlenmiş Hücrelerin Kaplanması

1. Sterilizasyon için kullanılacak kutuları ve balast ağırlıklarını otoklavlayın.
2. Plazma, silikon tabanlı plakaları 60 saniye boyunca sağ tarafı yukarı bakacak şekilde işlemden geçirin (bkz. adım 1.1). Plakaları hemen 15 dakika boyunca% 70 etanol içeren steril kutulara daldırın.
3. Plakaları 30 dakika boyunca ayrı steril kutularda steril fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) batırın.
4. PBS'yi kuyulardan aspire edin. Kuyucukların plazma işlemini kaybetmesini önlemek için her seferinde sadece bir plakayı kurutun.
   Dikkat: Silikon tabanlı plakalar, pipetleme sırasında sert plakalara göre daha az dokunsal geri bildirim sağlar ve pipetin ucunu tıkama olasılığı daha yüksektir.
5. Sterilize edilmiş plakalara oyuk başına 100 μL 0.1 mg / mL poli-L-ornitin (PLO) ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
6. Kuyucukları 100 μL steril PBS ile iki kez durulayın, ikinci yıkamayı hücre süspansiyonu hazır olana kadar kuyucuklarda bırakın.
7. Koruyucu eldiven kullanarak hiPSCN şişesini sıvı nitrojen deposundan çıkarın ve kuru buzun üzerine yerleştirin. Şişeyi hızlı bir şekilde 37 °C'lik bir su banyosuna taşıyın ve tam olarak 3 dakika çözdürün. Şişeyi döndürmeyin.
8. Steril bir başlıkta, şişenin içeriğini 1 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik bir konik tüpe nazikçe aktarın.
9. Boş kriyojenik şişeyi 1 mL oda sıcaklığında tam bakım ortamı (ortam tabanı + takviyesi) ile durulayın.
10. 1 mL medyayı saniyede yaklaşık bir damla ile damla damla 50 mL'lik tüpe aktarın. Eklerken tüpü hafifçe döndürün. 50 mL'lik tüpe yaklaşık 2 damla/s'de 8 mL oda sıcaklığında tam bakım ortamı ekleyin.
11. Tüpü kapatın ve 2-3 kez ters çevirin. Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Hücre süspansiyonunu 225.000 hücre/mL'ye seyreltmek için gereken ek ortamın hacmini hesaplayın.
12. Ortam miktarını (yukarıda hesaplanan) 25 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak hücre süspansiyonu tüpüne nazikçe pipetleyin.
13. Hücre süspansiyonunda 10 μg/mL laminin elde etmek için 1.000 μL'lik bir mikropipet ile 1 mL hücre süspansiyonu başına 10 μL 1 mg/mL laminin stoğu ekleyin. Laminin için kullanılan uçla bir kez yukarı ve aşağı aspire edin, ardından tüpü kapatın ve tüpü bir kez ters çevirin.
14. PBS'yi plakalardan her seferinde bir plaka olacak şekilde aspire edin. Her bir oyuklu kanala 100 μL hiPSCN hücre süspansiyonu eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın. Kuyucukların kültür alanı 0.33^cm2'dir, bu nedenle alan başına hücre yoğunluğu 67.500 hücre/^cm2'dir.
15. Yapışmayı teşvik etmek için tohumlamadan sonra plakaları 15 dakika oda sıcaklığında dinlendirin. Steril kültür davlumbazının fan titreşimlerini önlemek için, kapalı plakaları laboratuvar tezgahının üzerine yerleştirin. Kültürleri 37 ° C'de% 5 CO₂ ile inkübe edin.
16. Kuyuları 200 μL tam bakım ortamı ile yeniden doldurarak 24 saatte tam bir ortam değişimi gerçekleştirin. Her 2-3 günde bir 100 μL/kuyucuk yarım ortam değişikliği yapın.

5. Yaralı Kültürler

1. Girinti bloğunu hizalayın ve adım 2.2'de açıklandığı gibi sıfır konumunu bulun. Girintileri adım 2.3'te açıklandığı gibi yağlayın.
2. 'konum izleyici VI'da yer değiştirme geçmişi için dosya adını ayarlayın (adım 2.4.4). 'Hareket kontrolü VI'da yaralanma parametrelerini ayarlayın (adım 2.4.5).
3. Yaralanacak plakayı kuvözden çıkarın ve sahneye sıkıştırın. Kültürleri oda havasına maruz bırakmadan plakayı sabitlemek için kapağın konumunu ayarlayın.
4. 'Hareket kontrolü VI'yı kullanarak plakayı sıfır noktasına indirin (adım 2.2.4-2.2.6). 'Konum izleyici VI'yı başlatın (adım 2.4.4).
5. Plakayı girintilemek için hareket kontrolü VI'yı kullanın (adım 2.4.6'da açıklandığı gibi). Sahte esnemeler için yalnızca bu adımı atlayın.
6. Sahneyi hareket aralığının en üstüne geri getirin (bkz. adım 2.4.7). Plakayı inkübatöre geri koyun.
7. Yer değiştirme izini inceleyin ve kaydedin (adım 2.4.8'de olduğu gibi).

Sonuçlar

Şekil 1: Yaralanma cihazının etiketli bir şeması.(A) Üstten görünüm, (B) izometrik görünüm, (C) önden görünüm, (D) sağdan görünüm. Ölçek çubuğu ortografik görünümlere (A, B ve D) uygulanır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
.010" Silikon Levha	Özel İmalat A.Ş	#70P001200010	Polidimetilsiloksan (PDMS) sayfası
Işıltı	Balıkçı Bilimsel	#043204
Nunc 256665	Balıkçı Bilimsel	# 12-565-600	Dipsiz 96 Kuyulu Plaka
Kim Mendil	ULINE (TÜRKÇE)	S-8115 Serisi
Plazma Temizleyici	Harrick Plazma	#PDC-001-HC
(3-Aminopropil) trietoksisilan	Sigma-Aldrich	#440140	APTES (APTES)
Parşömen Kağıdı	Reynolds	Yok
Tavan Işığı	CCS inc	LFX2-100SW
Dome Işık Güç Kaynağı	CCS inc	PSB-1024VB
Aksiyel Dağınık Aydınlatma Ünitesi	Siemens	Nerlite DOAL-75-LED	Dağınık eksenel ışık
Yüksek Güçlü LED Dizisi	Cree	XLamp CXA2540	Yüksek Güçlü LED Dizisi
LED tutucu	Molex Belediyesi	1807200001	LED Tutucu
LED güç kaynağı	İyi Demek	HLG-320H-36B	Sabit Akım Güç Kaynağı
FastCam Viewer yazılımı	Fosfor		Kamera yazılımı
Hızlı Kamera Mini UX50	Fosfor	Yok	Yüksek Hızlı Kamera
Mikro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	Yüksek Hızlı Kamera Lensi
0.1 mg / mL Poli-L-Ornitin	Sigma-Aldrich	#P4597
iHücreler	Hücresel Dinamik Uluslararası	#NRC-100-010-001
iCell ortamı	Hücresel Dinamik Uluslararası	#NRM-100-121-001
iCell takviyesi	Hücresel Dinamik Uluslararası	#NRM-100-031-001
Laminin	Sigma-Aldrich	#L2020
ses bobini aktüatörü	BEI Kimco	LA43-67-000A
Optik Lineer Kodlayıcı	Renishaw	T1031-30A
servo sürücü	Copley Kontrolleri	Xenus XTL
denetleyici	Ulusal Enstrümanlar	cRIO 9024 Gerçek Zamanlı PowerPC Kontrol Cihazı
cRIO şasi	Ulusal Enstrümanlar	cRIO 9113
Dijital Giriş Modülü	Ulusal Enstrümanlar	NI 9411 Serisi
Veri edinme kasası	Ulusal Enstrümanlar	NI 9113
Laboratuvar GÖRÜNÜMÜ	Ulusal Enstrümanlar
hiPSCN'ler	Hücresel Dinamik Uluslararası

. Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Teknolojisi Serisi Serisi