$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvanlar
- Standart koşullar altında 6 ila 9 ay arasında yaşlandırılan TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebra balığı 167 (AB) suşunu, 26,5 °C sıcaklıkta ve 14/10 saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip suda koruyun.
2. Tersinir Sistemik Anestezi
- 400 mg trikin tozunu 97.9 mL tank suyunda ve 2.1 mL 1 M Tris tamponlu salin (TBS) içinde çözerek etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (tricain) stok çözeltisini hazırlayın. 1 M Tris (pH 9) ile pH 7.0'a ayarlayın ve karanlıkta 4 °C'de bir aya kadar saklayın.
not: Trikain, hayvanın doğal yaşam koşulları gibi suda hazırlanmalı, tercihen orijinal tank suyu kullanılmalıdır.
- Stok çözeltisini tank suyunda 1:25 oranında seyreltin ve hemen kullanın.
- Zebra balıklarını 50 mL anestezi solüsyonu içeren 10 cm'lik bir Petri kabına, hareketsiz hale gelene ve dış uyaranlara yanıt vermeyene kadar (kilo ve yaşa bağlı olarak yaklaşık 2-5 dakika) yerleştirin.
- Lazer tedavisi için her balığı elle özel yapım bir silikon pim tutucuya aktarın (Şekil 1A).
Dikkat! Balıklar tankın dışında sadece 10 dakikaya kadar anestezi altında kalabilir.
- Tedavi ve/veya görüntülemeden sonra anesteziyi tersine çevirmek için zebra balığını tank suyu içeren kaba koyun.
- İyileşmeyi desteklemek için, zebra balığını suda ileri geri hareket ettirerek solungaçlar üzerinde bir taze tank suyu akışı oluşturun.
3. Retinada Lazer Fokal Yaralanma
NOT: Zebra balığının retinasında odak ışığı hasarı oluşturmak için 532 nm diyot lazer kullanılır. Lazerin deneysel kurulumu, yetişkin zebra balıklarında tekrarlanabilir bir fokal retina yaralanmasının oluşturulmasını sağlar.
- Lazerin çıkış gücünü ayarlayın: 70 mW; hava çapı: 50 μm; darbe süresi: 100 ms.
Dikkat! Lazer ışığının kullanımı, alanın uygun şekilde kişisel olarak korunmasını ve etiketlenmesini gerektirir.
- Tedaviden önce göze topikal olarak 1-2 damla %2 hidroksipropilmetilselüloz uygulayın ve lazer hedefleme ışınını retinaya odaklamak için 2.0 mm fundus lazer lensi kullanın.
Dikkat! Hidroksipropilmetilselüloz damlaları viskozdur ve solungaçlara giderse nefes almada sorunlara neden olabilir.
- Sol gözdeki optik sinirin etrafına dört lazer noktası yerleştirin ve tedavi edilmemiş sağ gözü iç kontrol olarak kullanın.
