Gerçek Zamanlı Döngüsel Adenozin Monofosfat Testi Kullanılarak Koku Reseptörü Aktivasyonunun Ölçülmesi

Özet

Kaynak: Zhang, Y. et al., Gerçek Zamanlı cAMP Testi Kullanılarak Koku Verici Reseptör Aktivasyonunun Canlı Hücre Ölçümü. J. Vis. Uzm.(2017)

Bu video, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörü ve lüminesans tespiti kullanarak transfekte edilmiş hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunu ölçmek için kullanılan protokolü gösterir. Yöntem, koku alma nöronlarındaki reseptör-ligand etkileşimlerini ve sinyal yollarını incelemek için uygulanır.

Protokol

1. Gerçek Zamanlı cAMP Testi Kullanılarak Koku Reseptörü (OR) Aktivitesinin Uyarılması ve Ölçülmesi

1. Oyuk başına% 50-80'lik uygun bir birleşme sağlamak için transfekte edilmiş hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin ve inkübatöre geri dönün.
2. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS) 10 mM hidroksietil piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 5 mM glikoz ekleyerek stimülasyon ortamını hazırlayın.
3. Gerçek zamanlı cAMP tahlil substrat reaktifi alikotlarını buz üzerinde çözün. Substrat reaktifini polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüplerinde tüp başına 55 μL'de -80 °C'de saklayın. Plaka başına 1 tüp kullanın.
4. 55 μL substrat reaktifi ve 2750 μL HBSS/HEPES/glikoz çözeltisini karıştırarak% 2 dengeleme çözeltisi hazırlayın.
5. Bankın üzerine kalın bir tabaka kağıt havlu yayın. Plakayı kağıt havlunun üzerine baş aşağı hafifçe ve tekrar tekrar vurun, böylece transfeksiyon ortamı tamamen onun tarafından emilir.
6. Her kuyucuğa 50 μL HBSS / HEPES / glikoz çözeltisi pipetleyerek hücreleri yıkayın.
7. HBSS/HEPES/glikoz çözeltisini 96 oyuklu plakadan nazikçe ve tekrar tekrar dışarı vurun.
8. Her bir oyuğa 25 μL% 2 dengeleme çözeltisi pipetleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
9. Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1 M koku stok çözeltisini önceden hazırlayın ve kullanılana kadar -20 °C'de saklayın.
10. İnkübasyon süresinin bitiminden önce, koku verici stok çözeltilerini HBSS/HEPES/glikoz stimülasyon ortamındaki çalışma konsantrasyonlarına seyreltin.
    not: Bu adımda hazırlanan koku verici seyreltmelerin konsantrasyonları, her bir oyukta doğru nihai konsantrasyonları elde etmek için iki katına çıkarılmalıdır.
11. Bir kemilüminesans plaka okuyucusu kullanarak ve koku verici ilavesinden önce, plakanın bazal lüminesans seviyesini kuyu başına 1000 ms hızında art arda 2 kez ölçün.
12. Plakayı plaka okuyucudan hızlı bir şekilde çıkarın, her bir oyuka 25 μL koku seyreltmesi ekleyin ve 30 dakika içinde 20 döngü boyunca tüm kuyucukların sürekli lüminesans ölçümünü hemen başlatın.
    not: Aynı plakada farklı koku maddeleri ve/veya aynı koku maddelerinin farklı konsantrasyonlarını kullanırken komşu kuyucukların kirlenmesini önlemek için dikkatli bir şekilde pipetleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMSO (Türkçe)	Sigma	D2650
GloSensor cAMP reaktifi	Promega	E1290
HBSS, kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan	GIBCO Bilişim Teknolojileri	14175095
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Klon	SH30237
Kas konisi	Santa Cruz Plajı	SC-200528
Misk tibeten	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, kalsiyum veya magnezyum içermez	Hücre Kanalı	21-040-Özgeçmiş
0.2 mL PCR tüpü	Aksiyen	PCR-02-C
1,5 mL Eppendorf tüpü	Eppendorf Belediyesi
15 mL 17 mm x 120 mm konik boru	BD Şahin	352096
8 kuyulu ve/veya 12 kuyulu çok kanallı pipetleyici	Eppendorf Belediyesi
96 oyuklu düz tabanlı beyaz hücre kültürü plakası	Greiner	655098
100 mm x 20 mm hücre kültürü kabı	BD Şahin	353003
Sonsuz F200 plaka okuyucu	Tecan