İyon Seçici ve İyontoforez Mikroelektrotları Kullanılarak Bir Beyin Dilimindeki Hücre Dışı Boşluğun Karakterize Edilmesi

Abstract

Kaynak: Odackal, J., et al. Beyin hücre dışı boşluğun hacim fraksiyonunu ve kıvrımlılığını ölçmek için tetrametilamonyum ile gerçek zamanlı iyontoforez. J. Vis. Uzm. (2017)

Bu video, elektrik sinyallerini ölçmek ve karşılaştırmak için iyon seçici ve iyontoforez mikroelektrotları kullanarak bir beyin dilimindeki hücre dışı boşluğun nasıl karakterize edileceğini gösterir. Bu işlem, boşluğun hacim fraksiyonunu ve bükülme derecesini belirlemeye yardımcı olur.

Protocol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Beyin Dilimlerinde Gerçek Zamanlı İyontoforez

1. Kayıt odasına 400 μm kalınlığında bir beyin dilimi yerleştirin ve akan yapay beyin omurilik sıvısına (ACSF) tamamen daldırıldığından emin olun. Dilimi bir suluboya fırçası kullanarak yerleştirin ve bir ızgara ile nazikçe sabitleyin.
2. Hem iyontoforez mikroelektrodunu hem de ISM'yi beyin dilimi üzerindeki ilgi alanının üzerine hareket ettirin. Her ikisini de akan ACSF'ye, ancak dilimin üzerine daldırın.
3. Hem referans hem de iyon algılama kanalları için voltajı "0" mV'a kaydırın. Her iki kanaldaki voltajın stabilize olmasını bekleyin. Grafik kaydedicide, ISM'nin iyon algılama kanalında ölçülen voltajı işaretleyin. Wanda'daki taban çizgisi V parametresini hesaplamak için bunu kullanın.
4. ISM ve iyontoforez mikroelektrodunu dilimin 200 μm derinliğine ve birbirinden 120 μm uzağa yerleştirin. Mikroelektrodu beyin dilimine taşıdıktan sonra sinyalin stabilizasyonunu bekleyin.
   not: İyontoforez mikroelektroduna uygulanan önyargı akımı, küçük bir tetrametilamonyum (TMA) birikimine neden olur. Çok erken kayıt almak ve sinyal oluşumunu hafife almak yaygın bir hatadır.
5. Grafik kaydedicide, ISM'nin iyon algılama kanalındaki beyin diliminde ölçülen stabilize voltajı işaretleyin. Adım 8.3 ve adım 8.4'te ölçülen TMA sinyali arasındaki voltaj farkını hesaplayın ve bu değeri Wanda GUI'nin Ölçüm Elektrodu kutusundaki "Baseline V (mV)" alanına girin.
6. GUI'nin sol tarafında, tüm deneysel parametrelerin doğru şekilde kaydedildiğinden/girildiğinden emin olun. "Orta"yı "Beyin"e, "Taşıma numarası"nı adım 7.4'te iyontoforez mikroelektrodu için hesaplanan ortalama değere ve "Sıcaklık"ı dilimi içeren banyonun sıcaklığına ayarlayın.
   NOT: Her ölçüm seti için V kaydedilmelidir. Taban V, Wanda tarafından taban çizgisi C (mM) parametresine (yani, beyin dokusundaki TMA konsantrasyonu) dönüştürülecektir.
7. "Al" ı tıklayarak kaydı başlatın ve tam bir kayıt almasına izin verin. Yeni bir kayıt almadan önce TMA sinyalinin taban çizgisine dönmesini bekleyin.
8. Mikroelektrotları seçilen beyin konumundan çıkarmadan önce iki ila üç ardışık kayıt yapın. Ölçülen sıcaklığı her kayıttan hemen önce Wanda yazılımına girin.
9. Her iki mikroelektrotu da çapraz olarak dilimin yüzeyine geri hareket ettirin. Her ikisini de dilimin en az 50 μm üzerine yükseltin. Grafik kaydediciyi kullanarak, şu anda ölçülen V ile adım 8.3'teki ölçümü arasındaki herhangi bir değişikliği belirleyin.
10. ISM'nin uçlarını ve iyontoforetik mikroelektrotları x, y ve z eksenlerinde birbirine göre ortalayın. Varsa boşluk değişikliklerini mikromanipülatör kontrol kutusunun ekranından alın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ISM için amplifikatör	Dagan	Model IX2-700 Çift Hücre İçi Önamplifier	N = 0.1 (referans varil için) ve N = 0.001 (iyon varil için) kafa kademelerine sahip iyon ve referans voltaj amplifikatörü
Biyolojik bileşik miskroskopu (4x ve 10x objektif ile)			mikroelektrot uçlarını yontmak ve mikroelektrotları incelemek için; çeşitli tedarikçiler, örneğin AmScope
borosilikat teta kılcal cam boru	Harvard Aygıtı	Warner Instruments model TG200-4; sipariş #64-0811	iyon seçici mikroelektrotlar ve iyontoforetik mikroelektrotlar için çift namlulu cam boru; OD 2.0 mm, İç Çap 1.4 mm, septum 0.2 mm, uzunluk 10 cm
Grafik kaydedici			tetrametilemonyum standartlarında kalibrasyon sırasında ve RTI deneyi sırasında iyon seçici mikroelektrot üzerindeki voltajları sürekli olarak kaydetmek; örneğin Kipp ve Zonen tipi BD112 çift kanel tablosu kaydedildi, yenilenmiş olarak mevcut
Ticari Yazılımlar	Matematik İşleri	MATLAB, Veri toplama araç kutusu	Wanda ve Walter programlarını kullanarak veri toplama ve analizi için. Akademik bir lisansın mevcut olduğunu unutmayın.
Göz koruyucu gözlükler	balıkçı
Sabit Aşamalı Bileşik Mikroskop	Olympus	BX51WI	Sabit kademeli diğer bileşik mikroskopları kullanabilir
Forseps	Güzel Bilim Araçları	# 11251-10	cam kılcal damarları kırmak; Dumond #5, tercihen kullanılır ve artık ince işler için gerekli değildir
İyontoforetik ünite	Dagan	ION-100 ve PS-100	ION-100, +/- 130 V uyumluluğa sahip tek kanallı bir iyontoforez ünitesidir; PS-100 harici bir güç kaynağıdır; alternatifler: örneğin Axon Instruments (şimdi Molecular Devices) tarafından üretilen Axoprobe-1A, üretim dışı, yenilenmiş birimlerin (eBay ve diğer siteler) kullanılabilirliğini kontrol edin
Mikroelektrot tutucu	TEFE	M3301EH	silanizasyon için iyon seçici mikroeletrod prefabrike tutmak ve iyon seçici namlunun ucunu sıvı iyon değiştirici ile doldurmak; WPI, bu tutucunun şeffaf M3301EH ve siyah M3301EH olmak üzere iki versiyonunu satmaktadır. Deneyimlerimize göre, berrak M3301EH siyah M3301EH göre daha sağlam görünüyor.
Mikromanipülatör	Narishige (Narishig)	MM-3	silanizasyon sırasında iyon seçici mikroelektrot prefabrike konumlandırmak ve iyon seçici namlunun ucunu sıvı iyon değiştirici ile doldurmak için; iyi çalışma koşullarında herhangi bir üç eksenli mikromanipülatör ile ikame edilebilir
Amaç 5x kuru	Olympus	MPlan N
Amaç: 10x suya daldırma	Olympus	UMPlan FL N	10x objektif suya daldırma, sayısal açıklık 0,3, çalışma mesafesi 3,3 mm'dir
Sabit aşamalı mikroskop için platform ve XY translasyon aşaması	EXFO (Açıklama ve Açıklama Teklif	Cebelitarık Burleigh	Platform, dilim odasını, mikromanipülatörleri ve aksesuarları tutar, XY translasyon aşaması, kayıt kararlılığından ödün vermeden mikroskobu hareket
Hassas X, Y, Z konumlandırmalı robotik mikromanipülatör	Sutter Aletleri	MP-285	İyon seçici mikroelektrot ve iyontoforetik mikroelektrotu ayrı ayrı tutmak için iki mirkomanipülatöre ihtiyaç vardır. Mikropipetleri aralıklı bir dizide yapıştırmak da mümkündür (metne bakın).
Alçak geçirgen filtreli sinyal koşullandırma ünitesi	Akson Aletleri	CyberAmp 320 veya 380	artık üreticiden temin edilemez, ancak E-Bay'den temin edilebilir; alternatifler: örneğin Cygnus Technology'den FLA-01 Filtre/Amplifikatör. Bu, çok kutuplu bir Bessel filtresi kullanarak 10 Hz'de minimum kesmeye sahip tek kanallı bir cihazdır, ancak şirket gerekirse daha düşük bir kesme frekansı (2 Hz) için değiştirmeye istekli olabilir.
gümüş tel	A-M Sistemleri	#7830	çap 0.015 ", çıplak (kaplama yok)
Dilim Odası	Harvard Aygıtı	Warner Modeli RC-27L	Bu daldırma dilim haznesidir; arayüz dilim haznesi kullanmayın
stereomikroskop			silanizasyon ve iyon seçici namlunun ucunu sıvı iyon değiştirici ile doldurmak için; yatay olarak monte edilmiş; çeşitli tedarikçiler
tetrametinamonyum (TMA) klorür	Sigma-Aldrich	T-3411	5 M çözümü; DİKKAT: akut toksisite (oral, dermal, soluma), kanserojenlik, su ortamı için tehlikelidir, tam açıklama için Sigma-Aldrich Güvenlik Bilgilerine bakın