Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cerrahi İşlem
Not: 20 erkek Sprague-Dawley sıçan, lateral ventrikül ve anterodorsal talamik çekirdeğe kompoze amiloid beta proteini (Aβ) ile mikroenjekte edildi ve kompozit Aβ ile tedavi edilen grup olarak belirlendi. Diğer 20 sıçan da aynı operasyona tabi tutuldu, ancak% 0.1 dimetil sülfoksit (DMSO) salin mikroenjeksiyonu aldı ve sahte olarak ameliyat edilen grup olarak belirlendi.
- Sıçanları inhalasyon yoluyla% 100 izofluran ile uyuşturun, daha sonra onları bir beyin stereotaksik aparatı üzerinde kısıtlayın.
- Başın üst kısmındaki kürkü cerrahi makasla tıraş edin ve iyodofor ile dezenfekte edin. Daha sonra başınıza tek kullanımlık bir cerrahi havlu örtün.
- Cerrahi bisturi ve makasla medyan longitudinal kalvarya boyunca baş derisi üzerinde bir kesi yapın.
- Deri altı dokusunu ve fasyayı ayırın, kanamayı durdurmak için kafatası kalvaryumunu steril kuru pamukla silin ve bregmayı bir işaretleyici kalemle işaretleyin.
- Regmayı başlangıç noktası olarak kabul eden Sıçan Beyin Stereotaksik Haritasına bakın, üç noktayı, anterodorsal talamik çekirdeği (ad) işaretleyin (posterior (P): bregmaya 2.0 mm; lateral (L): orta hatta 1.4 mm) rekombinant insan dönüştürücü büyüme faktörü-β1 (RHTGF-β1) enjekte etmek ve bir vidayı, lateral ventrikül (LV) alanını (posterior (P) sabitlemek için: Bregmaya 0,8 mm; amiloid beta proteini 25-35 (Aβ25-35) ve alüminyum triklorür (AlCl3) enjekte etmek için lateral (L): orta hatta 2.0 mm) ve ikinci vida sabitleme yeri (Ön (F): bregmaya 2.0 mm; lateral (L): orta hatta 1.5 mm).
- Kafatasının yukarıdaki üç noktasında belirtilen esnek bir kemik matkabı ile 1 mm çapında üç adet 1.5 mm çapında delik açın. Beyin dokusunun bıçaklanmasını önlemek için gerekenden daha derine vidalamayın.
- Kanamayı durdurun ve kafatası yüzeyini steril kuru pamukla tekrar tekrar temizleyin.
- Mikro enjeksiyon pompasına bağlı bir iğneyi beyne 4,6 mm derinlikte sokun ve reklam alanına nazikçe 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) enjekte edin. Enjeksiyondan sonra iğneyi 2 dakika bekletin ve iğneyi yavaşça dışarı çekin.
- Reklamın noktalarında belirtilen iki vidayı kafatasına ve kafatasının ikinci vida sabitleme yerine (1,5. adımda belirtilen) küçük bir tornavidayla sabitleyin. Beyin dokusunun bıçaklanmasını önlemek için gerekenden daha derine vidalamayın.
- Kanül implantasyon sistemini monte edin ve yüksek basınçla dezenfekte ettikten sonra sahte kanülü kılavuz kanüle yerleştirin.
- Paslanmaz çelik boru kılavuz kanülünü, sıçanların stereotaksik cihazının kanül tutucusunun yardımıyla kafatası deliğinden LV alanına 4,6 mm'den beyne yerleştirin.
- Protez taban malzemesini 1 mL başına 1,5 g oranında protez taban suyu ile karıştırın, macunu kılavuz kanül plastik kaideyi kaplayacak şekilde koyun ve kılavuz kanülü hareketsiz hale getirmek için iki vida ve cilt enfeksiyonunu önlemek için tüm cilt kesisini kaplayın.
- Operasyonun 2. gününde, sıçanlar küçük hayvan anestezi makinesi kullanılarak izofluran inhalasyonu ile uyuşturuldu. Kukla kanülü dışarı çekin, iç kanülü kılavuz kanüle yerleştirin ve iç kanülü hareketsiz hale getirmek için sabitleme vidasını vidalayın.
- Mikroenjeksiyon pompasını iç kanüle bağlayan polietilen boruyu ayarlayın ve enjeksiyon hızını 1 μL/dk olarak ayarlayın. Aβ25-35 veya AlCl3'ü LV'ye mikroenjekte edin.
- Sabahları 14 gün boyunca günde 4 μg (1 μL) Aβ25-35 ve öğleden sonra 5 gün boyunca günde 3 μL AlCl3 (% 1) izofluran anestezisi altında mikroenjekte edin.
- Enjeksiyonu bitirdikten sonra 5 dakika bekleyin, iç kanülü yavaşça dışarı çekin ve sahte kanülü tekrar kılavuz kanüle yerleştirin.
- Ameliyat sonrası 15. günde (Aβ25-35'in son enjeksiyon gününe karşılık gelir), kanül implantasyon sistemini sökün. Protez taban malzemesini cerrahi makas ve forseps ile nazikçe çıkarın, iki vidayı sökün, kılavuz kanülü dışarı çekin ve yarayı betadin ile dezenfekte edin. Kafatasının deliğini kemik çimentosu ile doldurun ve basit bir kesintili dikiş yöntemi kullanarak cildi dikin.
- Aynı işlemi sahte olarak çalıştırılan grupla da gerçekleştirin ve %0.1 DMSO salin mikroenjekte edin.
