Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
C57BL/6 (H-2b) 8 haftalık dişi fareler satın alındı ve C57BL/6 AQP4-/- fareler A. Verkman tarafından sağlandı.
1. Farelerin AQP4 Peptitleri ile Bağışıklanması
- Eksiksiz Freund'un adjuvan (CFA) çalışma stoğunu hazırlayın.
- Bir havan ve havan tokmağı kullanarak kurutulmuş bir Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) preparatını ince bir şekilde öğütün.
- Eksik Freund'un adjuvanına 37 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona öğütülmüş H4Ra ekleyin. CFA, 4 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
- Liyofilize antijen (Ag) AQP4 peptidini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona çözün. 4 °C'de veya buz üzerinde muhafaza edin.
- CFA/peptit emülsiyonu içeren bir musluk ile birleştirilmiş 2 luer kilitli şırınganın montajını hazırlayın.
- Pistonsuz bir cam luer kilitli şırıngayı, 3 erkek luer kilit bağlantısına sahip 2 naylon bir musluka takın. Kolu şırıngaya doğru çevirerek vanayı kapatın. Şırınganın açık ucunu yukarı yerleştirin ve şırınganın bir test tüpü gibi davranmasına izin verin. Daha fazla stabilite için bunu bir tüp rafına yerleştirin.
- CFA çalışma stoğunu ve Ag çözümünü girdaplayın. Açık şırıngaya 1: 1 hacim peptit / CFA ekleyin. Fare başına 200 μL CFA/Ag (4 x 50 μL) gereklidir.
not: Tipik olarak, muslukta yaklaşık 1 mL preparat kaybolur ve bu da bağışıklama için mevcut miktarı azaltacaktır. Bu nedenle, bunu gereken toplam hacmin hesaplanmasına dahil etmek önemlidir.
Örnek: 5 farenin aşılanması için: (200 μL/hayvan x 5 hayvan) + 1 mL ekstra hacim = 2 mL toplam CFA/Ag gereklidir.
- Cam pistonu şırıngaya yerleştirin ve yerinde tutarken, musluk yukarı doğru yönlendirilecek şekilde şırıngayı ters çevirin. Musluk kolunu kullanılmayan dişi bağlantıya getirin. Şırıngadaki fazla havayı çıkarmak için cam pistona dikkatlice basınç uygulayın. Sıvı, vananın ikinci erkek luer-kilit bağlantısını doldurur.
- Vananın ikinci erkek luer kilit bağlantısına ikinci bir cam şırınga (piston tam olarak takılmış) takın. Bu, mümkün olduğunca az fazla hava içeren bir musluk ile bağlanmış 2 cam şırıngadan oluşan kapalı bir sistem olmalıdır.
- Bir emülsiyon oluşturmak için, sıvıyı 2 şırınga arasında dönüşümlü olarak yaklaşık 2 dakika geçirmek için pistonları iterek karıştırın. Şırıngaları buz üzerinde yaklaşık 10 dakika soğutun. Preparatın viskozitesinde net bir değişiklik olana kadar soğutmayı ve karıştırmayı tekrarlayın, bu da çok sert, beyaz bir emülsiyon ile sonuçlanır. Emülsiyonu içeren şırıngaları 4 °C'de soğutun veya buz üzerinde tutun.
- Tüm emülsiyonu bir cam luer kilitli şırıngaya aktarın, boş cam şırıngayı çıkarın ve enjeksiyon için 1 mL luer kilitli bir şırınga ile değiştirin. Yeni şırıngayı emülsiyonla doldurun, musluktan çıkarın ve bir iğne takın (25G x 5/8).
- Tutarlılık için emülsiyonu "su testi" yapın. Emülsiyonun bir damlasını küçük bir su kabına boşaltın. Emülsiyon dağılmamalıdır, bu da enjeksiyona uygun olduğunu gösterir.
- Emülsiyon dağılırsa, enjeksiyona hazır değildir; sıvıyı cam şırıngalara geri aktarın ve karıştırmaya devam edin ve emülsiyon sertleşene kadar tekrar soğutun.
- Uygun kıvam elde edilene kadar emülsiyonu tekrar test edin.
- Donör AQP4-/- farelere deri altına (sc) AQP4 peptidi içeren emülsiyon enjekte edin. Her fareye 4 x 50 μL sc enjeksiyonu (toplam 200 μL (100 μg peptit)) yapılır. 4 bölge, kasık lenf düğümlerine (LN) drene olan alt karın bölgesinin her iki tarafını ve her koltuk altına medial olan göğüs duvarının her iki tarafını içerir ve bu da aksiller LN'ye akar. Evlat edinen transfer, alıcı fare başına 1-2 aşılanmış donör fare gerektirecektir.
2. T Hücre Kültürü ve Proinflamatuar T hücresi Polarizasyonu
- Bağışıklamadan 10-12 gün sonra, farelerden LN toplayın.
- Bir buz tepsisinde, bir hücre süzgeci (ağ boyutu 70 μm) ile donatılmış ve %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U/mL penisilin-100 μg/mL streptomisin (pen-streptomisin) (RFPS) içeren soğutulmuş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamı içeren 60 mm'lik Petri kapları hazırlayın.
- Fareleri CO2'ye maruz bırakarak ötenazi yapın, ardından servikal çıkık yapın. Fareleri% 70 etanole batırın ve ardından her bir ayak pedini bir diseksiyon tahtasına sabitleyin.
- Kasıktan boyuna ve her bacağın aşağısına doğru orta hat cilt kesisi kesin. Cildi peritondan uzaklaştırın ve tahtaya gergin bir şekilde sabitleyin. Kasık ve aksiller LN'yi diseke edin ve buz üzerinde RFPS içeren Petri kabına yerleştirin.
- Evlat edinici transfer deneyleri için, aynı bağışıklama grubundaki tüm hayvanlardan LN'yi birleştirin. Vβ kullanımının akış sitometrik analizleri için, LN'yi tek tek hayvanlardan ayırın.
- LN'yi içeren hücre süzgecini RFPS içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. LN hücrelerini süzgeçten geçirmek için steril 5 mL şırınga pistonunun düz ucunu kullanın, hücrelerin geri kazanılmasını kolaylaştırmak için 20-30 mL RFPS ile yıkayın. LN hücrelerini kültür zamanına kadar işlem boyunca buz üzerinde tutun.
- İki kez yıkayın, 393 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. İkinci yıkamadan sonra, LN hücrelerini T hücre ortamındaki (TCM) yeniden süspanse edin. TCM, %10 ısıyla inaktive edilmiş FBS, 292 μg/mL L-glutamin, 110 μg/mL sodyum piruvat ve 55 μM 2-merkaptoetanol ve pen-strep içeren RPMI içerir. Tipik olarak, donör fare başına 5 mL TCM'lik bir hacim kullanılır.
- LN hücrelerini sayın. Beklenen verim, aşılanmış fare donörü başına yaklaşık 3-6 x 107 LN hücresidir.
- Evlat edinen transfer için polarize kültürler ayarlayın.
- TCM'de 10 μg / mL Ag, 20 ng / mL rekombinant fare interlökini (IL) -23 ve 10 ng / mL rekombinant fare IL-6 ile mL başına 5 x10 6 LN hücreli bir Th17 polarize kültürü hazırlayın.
- Alternatif olarak, Th1 polarizasyonu için, TCM'de 10 μg / mL Ag ve 10 ng / mL rekombinant fare IL-12 ile mL başına 5 x10 6 LN hücreli bir kültür hazırlayın.
- Polarize kültür karışımının oyuklu başına 2 mL (1 x 107 hücre) 12 oyuklu bir plakaya ekleyin. 2-4 donör fareden alınan LN hücreleri, 12 oyuklu bir plakayı dolduracaktır. Kültürleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO2 ile 72 saat boyunca koruyun.
- Kültürdeki LN hücrelerini 48 saat ve 72 saatte aktivasyon açısından görsel olarak kontrol edin. Aktive edilmiş hücreler geniş kümeler oluşturacak ve T hücrelerinin boyutu artarak daha pleomorfik hale gelecektir. Metabolizmadaki artış, ortamdaki pH'ın düşmesine ve şeftaliden portakala dönüşmesine neden olacaktır. PH, ortamı sarıya çevirecek kadar düşükse, kalan 24 saat içinde hücrelere toksisiteyi önlemek için 1 mL taze TCM ekleyin.
- Evlat edinme transferi için devam edin.
3. Patojenik AQP4'e özgü T hücrelerinin Evlat Edinme Transferi
>NOT: Bu adım, Bölüm 2.5: T hücre kültürü ve proinflamatuar T hücresi polarizasyonundan sonra gelir.
- Polarize hücreleri, yerinden çıkarmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek ve bunları 50 mL'lik bir tüpe aktararak 12 oyuklu plakalardan kurtarın. Enjeksiyonlara kadar buz üzerinde tutun.
- Hücreleri sayın, soğuk PBS'de iki kez yıkayın ve PBS'de 1 x 108 hücre / mL'lik bir süspansiyon hazırlayın. Genel olarak, hücreleri bir saat içinde enjekte edin.
- Hücreleri döndürerek nazikçe karıştırın ve enjeksiyon sırasında 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın. 200 μL hücreyi (2 x 107) intravenöz olarak (i.v.) her fareye kuyruk damarı yoluyla uygulayın.
- Her alıcı fare i.p.'ye o gün ve 2 gün sonra 200 μL PBS içinde seyreltilmiş 200 ng B. pertussis toksini enjekte edin. Klinik hastalık belirtileri için fareleri günlük olarak izleyin.
