Embriyonik Murin Gastrointestinal Sistemindeki Nöronal Popülasyonların İmmünofloresan Boyanması

Özet

Kaynak: Barlow-Anacker, A. J., et al., Murin Enterik Sinir Sistemi Gelişimini Görselleştirmek için İmmün Boyama. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, immünofloresan ve konfokal mikroskopi kullanarak nöronal popülasyon dağılımını görselleştirmek ve analiz etmek için embriyonik murin gastrointestinal sisteminin immün boyamayı göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. İmmün Boyama Protokolü

1. Numuneler %30 sükroz içinde saklanmışsa, sallanan bir platformda 1x PBS'de 20 dakika boyunca 3 kez durulayın.
2. GI kanallarını RT'de 1 saat boyunca sallanan bir platform üzerindeki engelleme çözeltisine yerleştirin.
3. Bloke edici çözeltiyi çıkarın ve GI yollarını, sallanan bir platform üzerinde RT'de 4 saat veya 4 ° C'de O/N boyunca blokaj çözeltisi içinde seyreltilmiş uygun miktarda primer antikor ile inkübe edin. 1: 1.000 seyreltilmiş insan anti-Hu antikoru (hastadan elde edilen serum), 1: 1.000 seyreltilmiş tavuk anti-yeşil floresan proteini (GFP) antikoru ve 1: 100 seyreltilmiş keçi anti-ChAT antikoru kullanın.
   not: Bir hastadan lokal olarak elde edilen bir insan anti-Hu antikoru kullanıyoruz; bununla birlikte, anti-Hu antikorları ticari olarak temin edilebilir, örneğin fare anti-Hu (1:500 seyreltmede kullanın).
4. GI kanallarını 1x PBS'de 3 kez 5 dakika ve ardından RT'de sallanan bir platformda 1 saat durulayın.
5. 1x PBS'yi, RT'de 4 saat veya 4 ° C'de O / N'de sallanan bir platformda 1:500 oranında bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş ikincil antikorlarla değiştirin. Dylight, eşek anti-tavuk Cy2 ve eşek anti-keçi Cy5 gibi eşek anti-insan amin reaktif boya kullanın. Fare anti-Hu antikoru kullanılıyorsa, 1:500 oranında seyreltilmiş eşek anti-fare amin reaktif boya 405.
   kullanın not: Endojen GFP ve tdTomato ekspresyonunun yoğunluğu ve immün boyamanın netliği gelişimsel yaşla birlikte artar. Tipik olarak, kullanılan antikor hacmini azaltmak ve ayrıca dokunun verimli bir şekilde boyanmasını sağlamak için embriyonik bağırsakları 0.2 ml'lik tüplerde 150 μl boyama solüsyonu ile tek tek immün boyayız.
6. GI kanallarını 1x PBS'de 3 kez 5 dakika ve ardından RT'de sallanan bir platformda 1 saat durulayın.
7. DAPI ile birkaç damla floresan montaj ortamını bir cam slayt üzerine yerleştirin. GI kanalını floresan montaj ortamına daldırın ve doğrudan dokunun üzerine bir kapak camı ekleyin. Floresan montaj ortamı -G, yarı kalıcı bir sızdırmazlık sağlayan suda çözünür bir bileşiktir.
   not: Antikor solmasını ve fotoağartmayı önleyen gliserol bazlı bir montaj ortamı olan Vectashield gibi floresan montaj ortamı kullanın. Bu ürünlerin her ikisi de dokuların 4 °C'de uzun süre saklanmasını sağlar.
8. Konfokal bir mikroskop kullanarak her bir floroforun görüntülerini yakalayın. Tablo 1'de kullanılan floroforlar ve filtreler için uyarma dalga boylarını kullanın.
9. Görüntüleri yakalamak için kullanılan konfokal türüne bağlı olarak uygun yazılımı kullanarak bilgisayar destekli görüntü analizi gerçekleştirin.

Tablo 1: Konfokal görüntüleme uyarma dalga boyları, floroforlar ve filtreler. Uyarma dalga boyları, algılanabilir floroforlar ve kullanılan filtreler sunulmaktadır. Bu bilgi, çok renkli immünofloresan için ikincil antikor kombinasyonlarının seçiminde kullanılabilir.

Uyarılma			Emisyon
Lazer Hattı	Florofor Tipi	Örnekler	Fotoçoğaltıcı Tüp	Filtre Seçenekleri
408 deniz mili	mavi	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, çoğu kuantum noktası	1	BP 425-475 deniz mili
488 deniz mili	yeşil	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Yeşili, YO-PRO-1	2	BP 500-550 deniz mili
561 deniz mili	kırmızı	Alexa Fluor 546, 555, 568 ve 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Phycoerythrin (PE), Propidium İyot (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 deniz mili
638 deniz mili	Uzak Kırmızı	Alexa Fluor 633 ve 647, Allofikosiyanin (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 deniz mili

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fosfat Tamponlu Tuzlu	Oksoit	BR0014G
Sığır Serumu Albümini	balıkçı	BP1605
Triton X-100	Sigma	X100
Floresan kapsamı	Nikon	SMZ-18 stereoskop
1,5 mL Eppendorf tüpleri	VWR (VWR)	20170-038
Floromount-G	Güney Biyoteknoloji, Birmingham, AL	0100-01
Cam slaytlar	balıkçı	12-550-15
Kapak camı	VWR (VWR)	16004-330
Konfokal mikroskop	Nikon	Nikon A1 dijital fotoğraf
Nikon Öğeleri	Nikon

Su Serisi Serisi Serisi arası makinesi