$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hayvan Modeli
- Hemigot bijenik Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) fareleri (ateşböceği lusiferaz eksprese eden transgenik fareler) ile hemizigot Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) fareleri (ailesel A53T mutasyonu ile insan alfa-sinükleinini eksprese eden transgenik fareler)
çaprazlaması.
- İnsan alfa-sinükleinini kodlayan transgenin varlığı için gerçek zamanlı poliemeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve ateşböceği lusiferaz için standart PCR ile soyları genotipleyin.
- Hayvanları altı ila sekiz haftalıkken aşılayın.
2. Aşı Hazırlama
- 20 mM Tris-HCl'de (pH 7.2) 150 mM NaCl içeren Tris-tamponlu salin (TBS) tamponunda A53T mutasyonu ile monomerik rekombinant insan alfa-sinükleini hazırlayın.
- 5 gün boyunca 800 rpm ve 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcıda 3 μg / μL monomerik rekombinant insan alfa-sinükleini çalkalayarak aşılamalar için fibriller alfa-sinüklein hazırlayın.
- İntraperitoneal aşılamalar için 1 μg / μL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için fibril düzeneklerini fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltin.
- Alfa-sinüklein fibrillerini bir çubuk sonikatör ile 1 dakika boyunca parçalayın (her darbe arasında bir saniyelik duraklama ve %50'ye ayarlanmış bir genlik ile 0,5 s süreli 40 darbe). Çapraz tohumlama ile kontaminasyonu önlemek için, farklı aşılama hazırlamak için temiz sonikasyon probları kullanın.
3. İntraperitoneal Enjeksiyonlar
- İntraperitoneal enjeksiyonlar için, hayvanları 2 L / dk'lık bir akış hızı ve buharlaştırıcı% 2'ye ayarlanmış izofluran / oksijen ile soluyarak bir anestezi odasında kısa bir süre narkotize edin. Hayvanın ayak parmağını sıkıştırın ve uygun anesteziyi sağlamak için arka ayağını çekmediğini onaylayın.
- 27 G tek kullanımlık hipodermik şırıngayı 50 μL sonikasyonlu alfa-sinüklein fibrilleri veya PBS ile doldurun.
- Doğrudan farenin peritonuna enjekte edin ve hayvanı, başı araştırmacıdan uzağa ve yaklaşık 45 ° 'lik bir açıyla aşağı bakacak şekilde sırt pozisyonunda tutarak karın duvarının arkasında bulunan ince bağırsağa veya çekuma nüfuz etmekten kaçının. Anesteziden kurtulana kadar hayvanları izleyin.