Transgenik Nematodlarda Prion Benzeri Proteinlerin Hücre Arası Yayılımını İzlemek için Hızlandırılmış Görüntüleme

Özet

Kaynak: Nussbaum-Krammer, C. I., et al. Metazoan Model Organizma C. elegans Kullanılarak Prion Benzeri Proteinlerin Yayılmasının ve Toksisitesinin Araştırılması. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, kırmızı floresan proteini ile etiketlenmiş prion benzeri proteinleri eksprese eden C. elegans'ın in vivo görüntüleme prosedürünü göstermektedir. Protokol, zaman atlamalı konfokal mikroskopi için bir agaroz ped üzerinde nematodların hareketsiz hale getirilmesini, protein agregasyonunu ve hücreler içinde ve arasında taşınmayı ortaya çıkarmayı içerir. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklarla ilgili protein agregasyonunu incelemek için çok önemlidir.

Protokol

>1. Prion Benzeri Proteinlerin Hücre Arası Yayılımının In Vivo Hızlandırılmış Görüntüleme ile

İzlenmesi

>NOT: C. elegans yabani tip (WT) (N2) ve transgenik hatları standart yöntemlere göre büyütün ve yetiştirme sıcaklığını dikkatlice kontrol edin.

1. Monomerik bir kırmızı floresan proteini (mRFP) ile etiketlenmiş prion benzeri proteini ifade eden C. elegans'ın transgenik hatlarını oluşturun.
2. Standart yöntemlere göre yumurtlama veya ağartma ile senkronize popülasyonları hazırlayın.
   1. Yumurtlama ile senkronizasyon
      1. 10 - 20 gravid yetişkini bir tabağa aktarın ve 1-2 saat yumurta bırakmalarına izin verin. Yetişkinleri plakadan çıkarın ve döllerin istenen yaşa kadar büyümesine izin verin.
   2. Ağartma ile senkronizasyon
      1. Senkronize edilmemiş bir gravid yetişkin popülasyonu toplayın ve bunları bir alkalin hipoklorit çözeltisi (250 mM sodyum hidroksit (NaOH) ve ticari ağartıcının su içinde 1: 4 (h / h) seyreltilmesi (H₂O)) ile ağartın. Yumurtaları iki kez yıkayın (1 dakika boyunca 218 x g) M9 tamponu (21 mM Na₂HPO₄·7H_2O(di-sodyum hidrojen fosfat heptahidrat), 22 mM (potasyum dihidrojen fosfat) KH₂PO₄, 86 mM sodyum klorür (NaCl), 1 mM MgSO₄·7H_2O(magnezyum sülfat heptahidrat), dH₂O ekleyin 1 L'ye kadar).
      2. 20 ° C'de gece boyunca hafif çalkalama (O / N) ILE M9 tamponunda yumurtadan çıkmalarına izin verin. Solucan gelişimi, bir besin kaynağının yokluğunda L1 aşamasında durdurulacak ve senkronize bir popülasyon bırakacaktır. L1'leri OP50 E. coli bakterileri ile tohumlanmış taze Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarına aktarın ve döllerin istenen yaşa kadar gelişmesine izin verin.
3. Açıklandığı gibi bir mikroskop lamı üzerinde% 2 agaroz pedleri (H₂O cinsinden) hazırlayın.
   1. Ara parça olarak kullanılmak üzere tüm uzunlukları boyunca etiketleme bandı yerleştirilmiş iki mikroskop lamı hazırlayın. Aralarına üçüncü bir mikroskop lamı yerleştirin.
   2. % 2 agarozu H₂O içinde çözün ve temiz lam üzerine bir damla pipetleyin.
   3. Agar damlasının üzerine diğer üç slayta dik olarak dördüncü bir slayt yerleştirin. Pedi etiketleme bandıyla aynı kalınlığa düzleştirmek için hafifçe aşağı bastırın.
   4. Ara parçaları çıkarmadan ve slaytları nazikçe ayırmadan önce 1 dakika kurumasını bekleyin. Agar pedi bunlardan birine yapışacaktır.
4. Pede ~ 10 μl anestezik (M9 tamponunda 2 mM levamisol) pipetleyin ve bir platin tel kıracağı kullanarak ~ 10 hayvanı aktarın. Bir kapak fişi (~ 22 x 22 mm) ile örtün ve 1 saat içinde fotoğraf çekin.
5. Alternatif olarak, daha uzun bir süre boyunca film elde etmek veya hayvanların herhangi bir hareket olasılığını daha da azaltmak için, anestezik ve boncuk immobilizasyonunun bir kombinasyonunu kullanın.
   1. Tarif edildiği gibi% 10 agaroz pedleri (M9 tamponunda) hazırlayın ve 3 μl nanoküre boyut standartları çözeltisine (polistiren boncuklar, 100 nm) artı 3 μl anestezik (M9 tamponunda 4 mM levamisol) solucanlar ekleyin. Bir kapak fişi ile nazikçe örtün. Kurumayı önlemek için, lameli VALAP (eşit miktarda Vazelin, lanolin ve parafin mumu karışımı) ile kapatın.
6. Konfokal mikroskop kullanarak hareketsiz hale getirilmiş solucanları görüntüleyin.
   NOT: Sonuçlar, bir EM-CCD kamera ve MetaMorph gibi Mikroskopi Otomasyonu ve Görüntü Analiz Yazılımı ile donatılmış bir Eğirme Diski AF Konfokal Mikroskop kullanılarak elde edilmiştir, ancak diğer karşılaştırılabilir konfokal görüntüleme sistemleri de kullanılabilir.
   1. 63X veya 100X/1.4NA yağ objektifini kullanın ve solucanlar içeren mikroskop lamını mikroskop lam tutucusuna yerleştirin.
   2. Yazılımı açın. mRFP görüntüleme için lazer gücünü ve filtreleri ayarlayın. %10 güçte 561 nm lazer ve emisyon filtresini >600 nm kullanın.
   3. "Çok Boyutlu Edinim" i açın. "Ana" sekmesi altında, "Timelapse" ve "Günlükleri Çalıştır" kutularını işaretleyin (Donanım Otomatik Odaklama: kapalı).
   4. "Kaydetme" sekmesi altında, dosyaların kaydedilmesi gereken dizin klasörünü seçin veya oluşturun. Dosyaya bir ad atayın.
   5. "Dalga Uzunluğu" sekmesi altında, uygun aydınlatmayı seçin ve pozlamayı ve kazancı ayarlayın. Bireysel örneğe bağlı olarak (canlı görüntü kullanılarak değerlendirilir) 100 ila 300 msn arasında bir pozlama ve 100 ila 300 arasında bir kamera kazancı ile "YokoQuad Red" (veya mRFP görüntüleme için eşdeğer bir aydınlatma ayarı) kullanın.
   6. "Timelapse" sekmesi altında, "Zaman noktası sayısı" = 301, "Süre" = 5 dakika ve "Zaman/Aralık" = 1 sn'yi seçin.
   7. "Günlükler" sekmesi altında, Günlük'ü seçin: "AFC SET Z HOLD" ve "AFC Return to Z HOLD", Tür: "Özel" (iki kez), Başlangıç Noktası: "Zaman noktasının başlangıcı" ve "Zaman noktasının sonu". Bu otomatik odaklama seçeneği, aynı bölümü daha uzun bir süre boyunca görüntülemek için önemlidir.
   8. Kurulum tamamlandığında, "Al" a basın. Timelapse video ayrı TIFF dosyaları olarak kaydedilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
reaktif
Nanosfer boyut standartları 100 nm	Termo Bilimsel	3100Bir
Levamizol	Sigma	L-9756
ekipman
Sorvall Legend XTR Soğutmalı Santrifüj, 120VAC	Termo Bilimsel	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
96 pinli çoğaltıcı	Scionomix (Scionomix)		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro yüksek kapasiteli, inkübe çalkalayıcı	Dijital Laboratuvar		http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Kombi Reaktif Dispenseri	Titertrek Belediyesi		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Otomatik İş İstasyonu	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 çalkalayıcı	Yeni Brunswick		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=Products&contentID=1& catalognode=83389
M205 FA	Leica Belediyesi		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDijital CCD kamera	Hamamatsu		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Eğirme Diski AF Konfokal Mikroskop	Leica Belediyesi		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 kamera	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
yazılım
MetaMorph Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı	Moleküler Cihazlar		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Görüntü Analiz Yazılımı	Meyer Aletleri		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ResimJ	Nıh		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
ImageJ için wrMTrck eklentisi			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans suşları
N2 (AĞIRLIK)	Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570

Serisi Belediyesi (Bu sayfa İngilizce içeriğe sahip olabilir) Serisi