$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs (rAAV) Üretimi ve Saflaştırılması
Not: rAAV vektör üretimi ve saflaştırılması Leuven Viral Vektör Çekirdeği (LVVC) tarafından gerçekleştirilmiştir.
- Kısaca, DMEM ortamı% 2 fetal sığır serumunda 25kD lineer polietilenimin 150 nM NaCl transfeksiyon çözeltisi ve 1: 1: 1 oranında üç farklı plazmit kullanarak subkonfluent düşük (<50) geçişli yapışık HEK 293T hücrelerini transfekte edin. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saatlik inkübasyondan sonra, ortamı taze DMEM ortamı% 2 fetal sığır serumu ile değiştirin.
not: Plazmitler, AAV7 serotipi, CMVie gelişmiş sinapsin1 promotörü kontrolü altında insan A53T mutant alfa-sinükleini (α-SYN) kodlayan AAV transfer plazmidi ve pAdvDeltaF6 adenoviral yardımcı plazmidi için yapıları içerir.
- Geçici transfeksiyondan 5 gün sonra ortamı hasat edin ve teğetsel akış filtrasyonu kullanarak konsantre edin.
- rAAV vektör parçacıklarını bir iyodiksanol adım gradyanı kullanarak konsantre ortamdan saflaştırın.
- Genomik kopya (GC) tayini için standart gerçek zamanlı PCR tekniklerini kullanın. Bu protokolde, Parkinson hastalığı (PD) için α-SYN tabanlı bir sıçan modeli geliştirmek için 3.0 E11 GC/ml'lik bir vektör titresi kullanıldı.
>2. Sıçanın substantia nigra'sında (SN) rAAV α-SYN Vektörünün stereotaktik enjeksiyonu (Şekil 1)
- Normal 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüsü altında yaklaşık 200-250 g ağırlığındaki sekiz haftalık dişi Wistar sıçanlarını, peletlenmiş yiyeceklere ve musluk suyuna ücretsiz erişim ile barındırın.
- Sıçanı ketamin (60 mg / kg) ve medetomidin (0.4 mg / kg) karışımı içeren intraperitoneal (ip) anesteziye gönderin. Sıçan anestezi uygulandıktan ve farklı pençeleri sıkarken tepki vermediğinde, bir mikro transponder implanter kullanarak daha fazla tanıma için sıçanın arkasına deri altına bir mikro transponder uygulayın. Mikro transponderin doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini ve okuma cihazı tarafından okunup okunamadığını kontrol edin.
- Saçı kafa derisinin üstüne kesin. Hem kafa derisine hem de kulaklara lokal anestezik uygulayın. Cerrahi prosedürün geri kalanını aseptik teknikler kullanarak laminer bir akış altında gerçekleştirin.
- Fareleri iki kulak çubuğu, bir ağız ve bir burun çubuğu kullanarak stereotaktik bir kafa çerçevesine yerleştirin. Vücut ısısında bir düşüş olmasını önlemek için farenin vücudunu bir kağıt örtü ile örtün. Gözlerin kurumasını önlemek için oküler bir kayganlaştırıcı uygulayın.
- Saç derisini %70 izopropanol içinde jodyum %1 ile dezenfekte edin ve kafa derisinin orta hattında küçük bir kesi yapın. Kafatasındaki zarları nazikçe kazıyın ve tuzlu suyla durulayın. Kafatasının birkaç dakika kurumasını bekleyin. Kraniyal sütürleri ve iki referans noktasını gözlemleyin: Bregma ve Lambda.
- rAAV vektörünü SN'ye enjekte etmek için, Bregma'ya doğru koordinatları tanımlayın (ön-arka: 5.3 mm; mediolateral: 2.0 mm; ve dorsoventral: duradan hesaplanan 7.2 mm).
not: İlgilenilen her bölge için üç boyutlu koordinatlar, Bregma'yı anatomik referans noktası olarak uygulayarak, sıçan beyninin stereotaksik bir atlası kullanılarak hesaplanabilir.
- 10 μl'lik bir mikroenjeksiyon şırıngasını (30 gauge 20 mm) rAAV vektörü ile doldurun ve motorlu bir mikroenjeksiyon pompasına bağlı stereotaksik alete yerleştirin. Bir damla vektör bırakarak hacmi kontrol edin ve çok değerlikli bir temizlik deterjanı pH 9'u (örn. RBS) ortadan kaldırın.
- Kafanın kafa çerçevesine düz bir şekilde sabitlenip sabitlenmediğini görsel olarak kontrol edin ve sol-sağ ekseni değerlendirin. Bregma ve Lambda için anteroposterior ve mediolateral koordinatları dikkatlice görsel olarak tanımlayın ve stereotaktik çerçevenin dorsoventral kolunda 30 gauge 20 mm'lik bir iğne kullanarak yüksekliklerini ölçün.
- Bregma ve Lambda arasında maksimum 0,3 mm yükseklik farkı bırakın. İğneyi tekrar Bregma'ya yerleştirin ve stereotaktik çerçevenin anteroposterior ve mediolateral kolunu hareket ettirerek anteroposterior ve mediolateral koordinatları uygulayın.
- Enjeksiyon yerinde, kafatasının yüksekliğini ölçün ve Bregma'nın yüksekliğinden 0,3 mm'den fazla farklı olmadığından emin olun. Kafatasında yaklaşık 2 mm çapında bir delik açın. Dorsoventral koordinatı uygulamak için referans görevi görecek olan duranın yüksekliğini ölçün. Alternatif olarak, kafatası için sabit bir kalınlık (0,9 mm) çıkarın.
- 26 gauge bir iğne kullanarak duraya nüfuz edin ve kanı steril doku ile emdirin. Devam etmeden önce tüm kanamanın durmasını bekleyin.
- Önceden vektör çözeltisi yüklenmiş 10 μl mikroenjeksiyon şırıngasını beyne önceden belirlenen derinliğe (dorsoventral koordinat) yavaşça yerleştirin. İğne yerindeyken 1 dakika bekleyin. 0.25 μl/dk verimli motorlu mikroenjeksiyon pompasını kullanarak 3 μl vektör çözeltisi (3.0 E11 genom kopyası/ml (orta vektör dozu) veya 1.0 E12 GC/ml (yüksek vektör dozu) rAAV2/7 α-SYN veya eGFP kontrol vektörü) enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra, yavaşça çıkarmadan önce iğneyi 5 dakika daha yerinde tutun. Kaplamalı örgülü polyester 3.0 kullanarak kafa derisini dikin,% 70 izopropanol içinde% 1 jodyum ile dezenfekte edin ve hayvanı stereotaktik aletten nazikçe çıkarın. Önce burun ve ağız çubuğunu, ardından iki kulak çubuğunu gevşetin.
- Anesteziyi tersine çevirmek için, sıçana intraperitoneal olarak 0.5 mg / kg atipamezol enjekte edin ve sıçanı uyanana kadar 38 ° C'lik bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafese koyun. Vücut ısısının düşmesini önlemek için fareyi bir kağıt battaniyeyle örtün.
- İlk saatler için yiyecek ve suya kolay erişim sağlayın. Fareyi ilk birkaç gün izleyin. Gerekirse analjezi.
uygulayın
not: Kafatasındaki dikişlerin alınmasına gerek yoktur. 1-2 hafta sonra kafatası tamamen onarılır ve dikişler gevşer.
