$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Homojenizasyon ve Fraksiyonlama
- Doku seçimi
NOT: Sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak doğrulanmış AH olgularından donmuş postmortem frontal korteks dokusu seçildi (n=2). Amiloid plak dağılımının postmortem nöropatolojik değerlendirmesi, Alzheimer Hastalığı için Kayıt Defteri Oluşturma Konsorsiyumu yarı kantitatif skorlama kriterlerine göre yapıldı, ancak nörofibriler arapsaçı patolojisi Braak evreleme sistemine göre değerlendirildi.
- Sağlıklı kontrol (Ctl) ve patolojik olarak doğrulanmış AD vakalarından donmuş postmortem beyin dokusu elde edin. Kuru buz, forseps ve tıraş bıçağı kapları kullanarak, dokunun çözülmesini önlemeye özen göstererek, darası alınmış tek kullanımlık tartı botlarında her doku örneğinden ~ 250 mg gri madde bölümünü çıkarın. Homojenize edilecek her parçanın ağırlığını kaydedin.
- Dış gri madde ile iç beyaz madde arasındaki arayüzü bulmak için görsel olarak inceleyerek forseps ve jilet kullanarak ~ 250 mg gri maddeyi kesin. Beyaz maddeden ve daha da önemlisi büyük kan damarlarından veya kanlı bölgelerden, meninkslerden veya araknoid materyalden kaçının. Beyin dokusu olan tartı teknesini kuru buzlu polistiren kaplara yerleştirerek hızlı ve sık çalışarak kesme işlemi sırasında dokuyu donmuş halde tutun.
- Analitik bir terazi kullanarak her donmuş parçadan çıkarılan gri maddenin tam ağırlığını kaydedin. Dounce homojenizasyonu (5 mL/g veya %20 w/v) için gereken düşük tuzlu (LS) tampon hacmini (bkz. Tablo 1) hesaplayın.
- 1x proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteyli ile 10 mL LS tamponu hazırlayın ve buz üzerinde soğutun.
- Tartılan dokuyu ve tartı teknesini kuru buzdan çıkarın ve çözülürken yaklaşık 2 x 2 mm'lik parçalar halinde doğrayın. Buz üzerinde 2 mL önceden soğutulmuş dounce homojenizatör tüpüne aktarın.
- 1X proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli ile 5 mL / g (% 20 w / v) buz gibi düşük tuzlu (LS) tampon ekleyin.
- Yaklaşık 10 vuruş yüksek boşluklu havaneli A ve 15 vuruş düşük boşluklu havaneli B kullanarak beyin dokusunu buz üzerinde homojenize edin.
- Tüm homojenatı bir cam Pasteur pipeti kullanarak 2 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın. Tüpü "TH" (Toplam Homojenat), doku vaka numarası ve homojenat hacmi ile etiketleyin. 0.8 mL'yi etiketli 1.5 mL'lik bir tüpe alın. Herhangi bir fazla homojenat da benzer şekilde ayrıştırılabilir ve -80 °C'de saklanabilir.
- Her 0.8 mL alikota, sırasıyla 0.5 M ve% 1 w / v konsantrasyonlarına 5 M NaCl ve% 10 (a / h) sarkosilden 100 μL ekleyin. Tüpleri ters çevirerek iyice karıştırın ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Homojenatların sarkosil-tampon içinde olduğunu belirtmek için tüpleri "TH-S" (Toplam Homojenat-Sarkosil) ile etiketleyin (Tablo 1).
- Bir mikrotip probu kullanarak buz üzerinde% 30 genlikte (maksimum yoğunluk =% 40) üç 5 sn darbe için her tüpü sonikleştirin.
- Biskinkoninik asit (BCA) tahlil yöntemini kullanarak homojenatların protein konsantrasyonlarını belirleyin.
not: Bir gram doku başına 5 mL LS'de hazırlanan TH-S homojenatlarının ortalama protein konsantrasyonu 15-20 mg/mL'dir. Homojenatlar hemen fraksiyonlanabilir veya kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.
- TH-S homojenatlarını 1x proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile buz gibi soğuk sark tamponu (Tablo 1) kullanarak 10 mg / mL'ye seyreltin.
- Her TH-S homojenatının 5 mg proteinini (0.5 mL) 500 μL polikarbonat ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve sark-tampon ile çift dengeleyin. Tüpleri önceden soğutulmuş bir rotora yükleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 180.000 x g'da ultrasantrifüj edin. Sarkosilde çözünen süpernatanları (S1) 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve -80 °C'de saklayın.
NOT: (İsteğe bağlı yıkama) Deterjanda çözünmeyen fraksiyonları (P1) içeren ultrasantrifüj tüplerine 200 μL sark tamponu ekleyin ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak peletleri (P1) ultrasantrifüj tüplerinin altından çıkarın.
- Peletleri (P1) aktarmak ve aşağıdaki 1,5 mL'lik tüplere tamponlamak için ters çevrilmiş tüpleri bir mikrosantrifüjde 2-3 s (≤2.500 x g) kısaca döndürün. Peletin bozulmasını sağlamak için yukarı ve aşağı pipetleyerek sark tamponundaki çözünmeyen peletleri (P1) yeniden süspanse edin.
- Çift balansı yapın ve 4 °C'de 30 dakika daha 180.000 x g'da santrifüjleyin.
- İsteğe bağlı yıkama süpernatantını (S2) atın ve sarkosilde çözünmeyen peletleri (P2) 50-75 μL üre tamponunda (Tablo 1) 1x PIC (proteaz ve fosfataz inhibitör kokteyli) ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin peleti çözündürmek için.
not: SDS çökelmesini önlemek için kullanmadan önce üre tamponunu oda sıcaklığına ısıtın. Deterjana duyarlı uygulamalar için, SDS'yi üre tamponundan çıkarın ve üre tamponunda yeniden süspanse etmeden önce çözünmeyen peleti (P2) düşük tuz tamponunda yıkamayı düşünün.
- Yeniden askıya alınmış peletleri (P2) 0,5 mL tüplere aktarın ve peletleri tamamen çözündürmek için% 20 genlikte (maksimum yoğunluk =% 40) kısa (1 s) mikro uçlu sonikasyon kullanın.
- BCA tahlil yöntemini kullanarak sarkosilde çözünen (S1) ve çözünmeyen (P2) fraksiyonların protein konsantrasyonlarını belirleyin. Bu fraksiyonları hemen kullanın veya kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
Tablo 1: Arabellek listesi
| % 10 w / v sarkosil çözeltisi: 100 ml ddH2O başına 10 g N-lauril-sarkozin sodyum tuzu (gece boyunca RT'de karıştırın) |
| Düşük Tuz (LS) tamponu: 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM sükroz, 1 mM EDTA |
| Sarkosil (sark) tamponu: LS tamponu +% 1 (a / h) sarkosil + 0.5 M NaCl |
| Üre tamponu (-20 °C'de saklayın): 50 mM Tris-HCl pH 8.5, 8M üre, %2 SDS |