Deneysel Bir Otoimmün Nörit Fare Modelinde Motor Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Abstract

Kaynak: Gonsalvez, D. G., et al., Fonksiyonel ve Nöropatolojik Değerlendirmeler için C57BL/6 Farelerde Deneysel Otoimmün Nöriti İndüklemek İçin Basit Bir Yaklaşım. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, Boğmaca toksini ve miyelini taklit eden peptitler ve adjuvanlar içeren bir aşının uygulanması yoluyla bir fare modelinde motor disfonksiyonu değerlendirme sürecini ve ardından motor fonksiyonu değerlendirmek ve immün aktivasyon ve demiyelinizasyona bağlı olarak ortaya çıkan sinir hasarını değerlendirmek için koşu bandı testlerini göstermektedir.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. EAN (Deneysel Otoimmün Nörit) İndüksiyonu

NOT: EAN, 6-8 hafta arasındaki erkek C57BL/6 farelerde başarıyla indüklenebilir. İndüksiyon protokolü toplam 9 gün sürer. 0. gün, ilk aşılamanın yapıldığı günü ifade eder. Bu protokol için enjeksiyonlar anestezi altında yapıldı (aşağıdaki adım 1.1.2'ye bakın).

1. -1. Günde:
   1. Steril 0.1 M fare izotonik fosfat tamponlu salin (MT-PBS) kullanarak 1.6 μg / mL'lik Boğmaca Toksini (Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisini hazırlayın.
   2. İzofluran ile anestezi:
      1. Fareyi (C57BL/6, erkek, 6-8 hafta) anestezi odasına yerleştirin ve oksijen akışını 1 L/dk'ya ayarlayın.
      2. İzofluran buharlaştırıcıyı açın, anestezitizasyon için% 2,5'e ayarlayın, solunumu izleyin ve 2 dakika veya birincil refleksler (kornea ve arka bacak) artık yanıt vermeyene kadar bekleyin.
   3. Fareyi anestezi odasından çıkarın ve 30_1/2 G iğne ile 0.5 mL'lik bir şırınga kullanarak intraperitoneal (ip) enjeksiyon yoluyla yukarıdaki Boğmaca Toksin çözeltisinden 250 μL uygulayın.
   4. Enjekte edilebilir aşıyı bağışıklama için hazırlayın:
      1. % 0.9 salin içinde 2 mg / mL P0180-199 peptit çözeltisi (% > 98 saflıkta, S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S s) kullanarak Çözelti A'yı hazırlayın.
      2. Freund'un tam adjuvanında (FCA,% 15 mannid monoolat +% 85 parafin yağı ve 0.5 mg / mL kurutulmuş, öldürülmüş ve kurutulmuş Mycobacterium butyricum içeren 20 mg / mL Mycobacterium tuberculosis çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak Çözelti B'yi hazırlayın.
      3. Enjekte edilecek son aşılamayı yapmak için, Çözelti A ve B'nin eşit hacimli parçalarını bir boncuk çırpıcıda birleştirin ve bunları oda sıcaklığında 1 dakika boyunca maksimum hızda karıştırın.
         not: Çözelti A ve B stok olarak saklanabilir ve en fazla bir ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir, ancak kombine son aşılama, fare enjeksiyonunun yapıldığı gün taze olarak hazırlanmalıdır.
2. 0. Günde, 50 μL aşıyı (adım 1.1.4'te özetlenen hazırlık) 23 G'lik bir iğne kullanarak deri altı enjeksiyon yoluyla bir fareye uygulayın.
   not: Enjeksiyon, omuz bıçakları arasına veya arka bacak ile kuyruk arasına kaudal sırt üzerinden yerleştirilebilir.
3. 1. Günde, 1.2 μg / mL'lik (MT-PBS'de) Boğmaca Toksin çözeltisini yapın ve 301/2 G iğne ile 0.5 mL'lik bir şırınga kullanarak ip enjeksiyonu yoluyla bir fareye 250 μL uygulayın.
4. 3. Günde, yukarıdaki adım 1.3'ü tekrarlayın.
   not: Stok çözeltileri A ve B hazırlanabilir ve en fazla bir ay boyunca 4 °C'de saklanabilir. Bununla birlikte, stok çözeltileri A ve B'nin birleştirilmesiyle üretilen son enjekte edilebilir aşı, enjeksiyonun yapıldığı gün yapılmalıdır.
5. 8. Günde, 50 μL aşıyı (adım 1.1.4'te özetlenen hazırlık) deri altı enjeksiyon yoluyla (yukarıdaki adım 1.2'ye bakınız) bir fareye adım 1.2'deki gibi aynı enjeksiyon bölgesinde (her hayvan için) uygulayın

2. Motor Fonksiyon Değerlendirmesi

NOT: Motor performans, aynı hayvan kohortu için klinik skorlamaya paralel olarak değerlendirilir. Motor fonksiyon değerlendirme cihazı, yürüme fonksiyonu görüntüleme sistemi (bkz. Malzeme Tablosu) kurulu olan bir bilgisayara bağlanmalıdır. Ayrıca, değerlendirilecek tüm farelerin EAN indüksiyonundan önce çalışan göreve alıştırılması önerilir. Bunu yapmak için, hastalık indüksiyonundan üç gün önce (Gün -3) alıştırma çalışmaları (fare başına 2 test çalışması) gerçekleştirilir.

1. Motor fonksiyon değerlendirme cihazını açın ve ışık düğmesini açın.
2. Fareyi sıkıca sıkıştırın ve kuyruğunu tutarken kırmızı mürekkeple dolu bir kabın üzerine indirerek ayaklarını mürekkepleyin.
   not: Bu adım C57BL/6 suşu için gereklidir, ancak beyaz kaplama rengine sahip bir fare suşu kullanılıyorsa atlanabilir.
3. Fareyi yürüme bölmesine yerleştirin ve koşu bandı hızını 15 cm/s'ye ayarlayın.
4. Koşu bandını açın ve yürüyüş işlevi görüntüleme sistemini kullanarak farenin koşu hareketini yakalamak için "kaydet" düğmesine tıklayın (bkz. Malzeme Tablosu).
5. Bir zamanlayıcı kullanın ve her koşuyu 36 saniye boyunca ölçün. 36 saniye sonra kaydı durdurun ve koşu bandını durdurun.
   not: Bu 36 saniyelik aralık boyunca çalışan görevi başarıyla tamamlayamayan fareler başarısız olmuş olarak kabul edilir.
6. Video dosyasını belirlenen klasöre kaydedin.
7. Değerlendirilecek her fare için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Fareleri her 3 günde bir aynı çalıştırma göreviyle test edin.
8. Yürüyüş fonksiyonu parametreleri için yazılım kullanarak düzenlenen video dosyalarını analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   not: Farklı motor parametrelerinin nasıl analiz edileceğine ilişkin ayrıntılar yazılımlar arasında farklılık gösterir, bu nedenle lütfen analizden önce üreticinin talimatlarına bakın. Araştırmanın özel amaçlarına bağlı olarak, immünohistokimya veya elektron mikroskobu yoluyla aksonal ve miyelin hasarının histolojik kanıtını elde etmek için motor fonksiyon sonrası değerlendirmenin herhangi bir aşamasında hayvan dokuları alınabilir.

Results

Tablo 1: EAN klinik skor paradigması.

Puan	kriter	Değerlendirme kriterlerine ilişkin notlar ve yorumlar
0	Normal fare
1	Daha az canlı VEYA köpük	Bu, normal kullanıma yanıt olar...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, erkek, 6-8 haftalık	Avustralya Biyokaynaklar Cenre, WA, Avustralya
Boğmaca toksini	Liste Biyolojik Laboratuvarlar, Inc., CA, ABD	#181
0,1 M fare izotonik fosfatlı tamponlu tuzlu su (MT-PBS)			Laboratuvarların kendi protokolleri olacaktır.
İzofluran	Pharmachem, QLD, Avustralya		Laboratuvarların uygulama için kendi protokolleri olacaktır.
P0180–199 peptit	Wuxi Nordisk Biyoteknoloji A.Ş. Teğmen SHG, CHN		P0180–199, dizi S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Isı öldürdü Mycobacterium tuberculosis (H37RA suşu)	Difco, MI, Amerika Birleşik Devletleri	#231141
Freund'un tam adjuvanı (FCA)	Difco, MI, Amerika Birleşik Devletleri	#263910
%16 Paraformaldehit (PFA)	Elektron Mikroskobu Hizmetleri	#15710	Doku toplama gününün% 4'üne seyreltin.
% 25 glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Avustralya	# 11-30-8	Fiksasyon gününde% 2.5 gluteraldehit ile seyreltin.
Sodyum azid	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Avustralya	SL189	0,1M MT-PBS'de %10 (a/h) stok oluşturun. % 0.03 (h / v) oranında kullanın.
Sakaroz	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Avustralya	SA030	%30'da (a/h) kullanın.
Optimum kesme sıcaklığı (OCT) orta	Sakura Finetek, CA, Amerika Birleşik Devletleri	#4583
Normal eşek serumu	Merck Millipore, MA, Amerika Birleşik Devletleri	#S30-100	% 10 (h / v) veya kendi laboratuvarı tarafından belirlenen başka bir konsantrasyonda antikor seyreltici olarak kullanın.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, Amerika Birleşik Devletleri	#90o2-31-1	% 0.3 (h / v) veya kendi laboratuvarı tarafından belirlenen başka bir konsantrasyonda antikor seyrelticisinde kullanın.
Tavşan anti-amiloid öncü proteini (APP)	Invitrogen (Yaşam Teknolojileri), CA, ABD	S12700 Serisi	1:400'de kullanılır veya kendi laboratuvarında titre edilir.
Tavşan anti-kontaktin ile ilişkili protein-1 (Caspr)	Prof. Dr. Elior Peles'ten Hediye, Wiezmann Bilim Enstitüsü, İsrail		1:500'de kullanılır veya kendi laboratuvarında titre edilir.
Uygun Alexa Fluor konjuge ikincil antikorlar	Moleküler Problar (Yaşam Teknolojileri), OR, ABD	çeşitli	1:200'de kullanın veya kendi laboratuvarında titre edin. Antikorun ortaya çıktığı türlerin ve Alexa Fluor'un seçilmesi her laboratuvarın takdirine bağlıdır.
Sulu montaj çözümü	Dako (Agilent), CA, Amerika Birleşik Devletleri	#S3023	Her laboratuvarın kendi tercihi olacaktır.
ekipman
301/2 g iğneli 0,5 mL şırınga	Bd	#326105
23 gr iğneler	Bd	#305143
Kırmızı mürekkep pedi			Hayvanların ayaklarını işaretlemek için herhangi bir kırmızı mürekkep pedi veya kırmızı gıda boyası kullanılabilir.
DigiGate aparatı (koşu bandı dahil)	eMouse Özellikleri Inc. Framingham, MA
DigiGate Görüntüleme Sistemi	eMouse Özellikleri Inc. Framingham, MA
kronometre			Herhangi bir zamanlayıcı kullanılabilir.
DigiGait 8 Yazılımı	eMouse Özellikleri Inc. Framingham, MA
Diseksiyon mikroskobu	Zeiss		Uygun herhangi bir diseksiyon mikroskobu kullanılabilir.
Şarjlı slaytlar	Superfrost Plus, Lomb Bilimsel Ticaret Ltd.	SF41296SP
Cyrostat (Cyrostat	Leica Belediyesi		Uygun herhangi bir cyrostat kullanılabilir.
Perfüzyon ekipmanları ve diseksiyon aletleri			Laboratuvarların kendi perfüzyon protoktolleri olacaktır.
Opak humifiye oda			Laboratuvarlar opak bir plastik kap kullanarak kendi ürünlerini üretebilirler.
PAP pene	GeneTex (AMERİKA BİRLEŞİK DEVLETLERİ)		Doku bölümünün etrafında bir kuyu oluşturmak için balmumu kalemi veya yüzey gerilimi de kullanılabilir.
Konfokal mikroskop	Zeis LSM780		Uygun lazer çizgilerine sahip herhangi bir konfokal mikroskop kullanılabilir.
FIJI/Resim J	Ulusal Sağlık Enstitüleri		www.fiji.sc'dan edinilebilir