1. Drosophila'da Gal4 ve QF Aracılı Htt Transgen Ekspresyonunun Birleştirilmesi
- Dokuya özgü Gal4 veya QF "sürücüleri" içeren transgenik Drosophila melanogaster hatlarının yanı sıra Gal4-UAS veya QF-QUAS'ın akış aşağısında vahşi tip veya mutant Htt transgenleri içeren hatları toplayın ve / veya oluşturun. Bu transgenlerden eksprese edilen proteinlerin, aynı sinekte mutant ve vahşi tip Htt transgen ürünlerinin farklılaşmasına izin vermek için floresan proteinlere veya epitop etiketli olduğundan emin olun. Bkz. Şekil 1.
NOT: Tipik olarak insan Htt geninin ekzon 1 fragmanlarını kullanırız. Bununla birlikte, istenirse daha uzun Htt fragmanlarını veya diğer genleri ifade etmek için transgenik sinekler üretilebilir.
- Genetik stratejiyi, mutant ve vahşi tip Htt transgenlerinin farklı, örtüşmeyen hücre popülasyonlarında ifade edileceği şekilde planlayın.
- Herhangi bir ekspresyon örtüşmesi meydana gelirse, aynı hücrelerde sentezlenen mutant ve vahşi tip Htt proteinleri birlikte toplanacak ve prion benzeri olayların tespit edilmesini önleyecektir. Bunu önlemek için, sırasıyla Gal4 ve QF'ye özgü baskılayıcıları, Gal80 ve QS40'ı kullanın (Şekil 1). Gelişimsel olarak kontrol edilen Gal4 ve / veya QF sürücülerinin seçilmesi, mutant Htt'nin post-mitotik hücrelere ekspresyonunu sınırlamaya yardımcı olabilir ve hücre bölünmesinin hücreden hücreye agrega yayılmasına katkıda bulunma olasılığını ortadan kaldırabilir.
- Standart kültür koşullarını kullanarak, bir "donör" hücre popülasyonunda QF (veya Gal4) yoluyla mutant Htt'yi ve bir "alıcı" hücre popülasyonunda Gal4 (veya QF) yoluyla vahşi tip Htt'yi eksprese eden döller oluşturmak için sinekleri çiftleştirin. Olası bir genetik kombinasyonu gösteren bir şema için Şekil 1'e bakınız.
not: Şekil 1-4'te ve önceki yayınımızda gösterilen verileri oluşturmak için kullanılan QF ve Gal4 sürücüleri, DA1 koku alma reseptörü nöron (ORN) sürücüsü, Or67d-QF ve pan-glial sürücü, repo-Gal4'ü içerir.
- Hem QF hem de Gal4 etiketli hücre popülasyonlarında vahşi tip Htt'yi ifade eden paralel olarak kontrol sinekleri oluşturun.
- İstenilen genotipin döllerini toplayın ve hayvanları uygun şekilde yaşlandırın.
2. Yetişkin Drosophila Beyinlerinin Mikro-diseksiyonu ve Fiksasyonu
NOT: Bu diseksiyon prosedürü önceki bir yayından değiştirilmiştir ve Htt-floresan protein füzyonlarından gelen doğrudan floresan sinyallerini görüntülemek için beyinleri hazırlamak için kullanılabilir.
- Aşağıdaki malzemeleri toplayın ve buzun üzerine yerleştirin: %0,03 Triton X-100 (PBS/T) içeren fosfat tamponlu salin; 770 μL PBS/T'ye 200 μL %20 PFA eklenerek hazırlanan 970 μL %4 paraformaldehit (PFA) fiksatif solüsyonu içeren mikrosantrifüj tüpleri; kuyu içeren şeffaf bir cam tabak; tek kullanımlık bir transfer pipeti; iki diseksiyon forseps (bir No. 3 ve bir No. 5).
- Yetişkin sinekleri CO2 kullanarak uyuşturun ve onları buz üzerindeki cam kabın bir kuyusuna aktarın.
- Bir transfer pipeti kullanarak, sinekleri içeren kuyucuğa ve boş bir kuyuya az miktarda (~ 500 μL) soğuk PBS/T ekleyin. Diseksiyonu engelleyebilecekleri için çok fazla baloncuk sokmaktan kaçının.
- Cam tabağı diseksiyon mikroskobunun altında düz bir yüzeye yerleştirin ve sinek gövdesi görüş alanını doldurana ve odakta olana kadar büyütmeyi ayarlayın.
- Bir çift deveboynu ışık kaynağını, ışık cam tabağın her iki tarafını da aydınlatacak şekilde yerleştirin. Diseksiyon sırasında vücut parçalarını/kütikülleri atmak için katlanmış bir laboratuvar dokusunu cam tabağın altına sabitleyin.
- Baskın olmayan eldeki 3 numaralı forsepsleri kullanarak, PBS / T içeren kuyucuğa tek bir sinek aktarın.
- Sineği tamamen PBS/T'ye batırılmış halde tutarak, baskın eldeki 5 numaralı forseps ile sinek kafasını çıkarın. Bu forsepslerin bir ucunu, sinek kafasının bir tarafındaki hortumun bitişiğindeki küçük boşluğa kütikülün altına yerleştirin. Gözü her iki taraftan tutmak için forsepsleri sıkıştırarak tutuşu kafaya sabitleyin.
- İki forseps birbirinden çekerek sinek kafasını vücudundan çıkarın. Sinek gövdesini yakınlarda bulunan bir laboratuvar mendili üzerine atın. Sinek kafasının kaybolmaması için baskın el forsepsleri üzerindeki baskıyı koruyun.
- 3 numaralı forsepsin bir ucunu, baskın olmayan elde, hortumun diğer tarafındaki kütikülün altındaki aynı küçük boşluğa yerleştirin. Yerleştirildikten sonra, başın her iki yanında aynı yerde gözleri kavramak için forsepsleri sıkıştırın.
- Kütikül üzerindeki kavrama sabitlendikten sonra, forsepsleri 180°'de nazikçe ayırın. Bu hareket, beyne zarar vermeden kafa kütikülünü parçalayacaktır. Bir laboratuvar dokusu üzerindeki kütikül kalıntısını atın.
- İdeal olmasına rağmen, kafa kütikülü tek adımda tamamen çıkarılamayabilir. Bu durumda, beyin tamamen açığa çıkana kadar kütikülü parça parça çıkarın. Forseps ile doğrudan temastan kaçınarak beyne zarar vermemeye dikkat edin.
- Diseke edilmiş beyni, ya bağlı bir trakeayı tutarak ya da kılcal hareketle beyni forseps uçları arasındaki boşluğa aspire ederek PBS/T'den çıkarın.
not: Trakeanın çıkarılması isteğe bağlıdır, çünkü tipik olarak görüntülediğimiz beynin ön yüzeyindeki anten loblarını gizleme eğiliminde değildir. Bununla birlikte, trakea görüntülemeye müdahale ederse, beynin bu manipülasyondan zarar görmemesi için bunları dikkatlice çıkarın.
- Sinek beynini, buz üzerinde fiksatif bir çözelti içeren mikrosantrifüj tüplerinden birine aktarın. Beynin forsepsten ayrıldığından ve fiksatif solüsyona daldırıldığından emin olun.
- Tüm beyinler diseke edildikten sonra, kapalı tüpleri karanlıkta oda sıcaklığında ~ 5 dakika boyunca bir nutatör üzerine yerleştirerek onları "kısa düzeltmeye" tabi tutun.
NOT: Bu kısa fiksasyon adımı, sonraki adımlarda beyinlerin daha kolay kullanılmasını ve mikrosantrifüj tüpünün kenarlarına yapışmamasını sağlar.
- Fiksatif solüsyonun çoğunu bir P1000 pipeti ile çıkarın ve atın.
- Bu ve sonraki herhangi bir yıkama adımı sırasında beyinleri tüpten aspire etmekten kaçının. P1000'i daha düşük bir hacme (örn. 650 μL) ayarlayın ve süpernatanı iki adımda çıkarın. Ek olarak, beyinleri daha iyi görselleştirmek için aspirasyon yaparken mikrosantrifüj tüplerini bir ışık kaynağıyla (örneğin tepe lambaları) aynı hizada tutun.
- Beyne 1 mL taze PBS / T ekleyin. Karanlıkta hızlı bir şekilde (< 1 dakika) yıkayın, süpernatanı beyinden aspire edin ve atın.
- PBS/T ile karanlıkta oda sıcaklığında aşağıdaki programa göre yıkamayı tekrarlayın: 2 hızlı (< 1 dakika) yıkama, 1 X 5 dakika, 3 X 20 dakika ve 1 X 1 saat yıkama. Kapakları mikrosantrifüj tüplerine sabitleyin ve tüpleri yıkamalar arasında bir nutatör üzerine yerleştirin.
- DAPI boyama isteniyorsa, son 1 saatlik yıkamayı PBS / T içinde seyreltilmiş 250 ng / mL DAPI ile 1 X 30 dakikalık inkübasyon ile değiştirin, ardından 2 X hızlı ve 1 X 20 dakika yıkama yapın.
- Son yıkamadan sonra, beyinleri rahatsız etmemeye dikkat ederek yıkama tamponu süpernatantının çoğunu çıkarın ve beyne 30 μL gliserol bazlı antifade reaktifi ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de hareket etmeden en az 1 saat ve 24 saate kadar inkübe edin.
3. Tüm Beyin Montajı
Bir - diseksiyon mikroskobunun altına bir cam mikroskop lamı yerleştirin ve tanımlayıcı bilgilerle etiketleyin.
NOT: Alternatif olarak, görüntüleme sırasında beynin her iki tarafına da erişmek için beyinler doğrudan bir kapak camına monte edilebilir. Bu montaj prosedürünü açıklayan bir protokol daha önce yayınlanmıştır45.
- Körelmiş bir pipet ucu (1-200 μL'lik bir ucun alt kısmını ~ 1 cm çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanılarak hazırlanır) kullanarak beyinleri her bir mikrosantrifüj tüpünden çıkarın ve slaydın ortasına aktarın. Mümkün olduğunca az antifade reaktifini beyinle aktarın.
- Beyni istenen yönde konumlandırmak için forseps kullanın (örneğin, anten lobunu görüntülemek için dorsal slaydın tepesine doğru ve ön yüzey yukarı bakacak şekilde). Beyinleri yönlendirirken, onları görüntülemek için kullanılacak mikroskobun ışık yolunu göz önünde bulundurun.
- Beyni rahatsız etmeden katlanmış bir laboratuvar dokusunun sivri köşesini kullanarak slayttan fazla antifade reaktifini çıkarın. Beynin slayta yapışmasını sağlamak için slaytı karanlıkta ~ 5-10 dakika bekletin.
- Sinek beyinlerini, ~ 19 mm x 19 mm boyutlarında bir kare oluşturmak için beynin her iki tarafına yerleştirilmiş dört küçük kırık kapak camı parçasıyla çevreleyin. 22 mm x 22 mm No. 1.5 kapak camının bir kenarını bu küçük cam parçalarından birinin hemen dışına yerleştirin ve köprü montajını tamamlamak için lameli nazikçe beynin üzerine indirin.
- Lameli veya beyni rahatsız etmemeye dikkat ederek, lamel altındaki yüzeyi doldurmak için taze antifade reaktifini yavaşça dağıtın. Lameli doğrudan temas etmeden katlanmış bir laboratuvar mendilinin sivri köşesini kullanarak fazla antifadeyi silin.
- Lamelin dört köşesinin her birine bir damla şeffaf, çabuk kuruyan oje ekleyin. ~ 10 dakika kurumaya bırakın. Ardından, beyni tamamen sarmak için lamel dört kenarını oje ile kapatın.
- Beyinleri hemen görüntüleyin veya hazır olana kadar 4 °C'de saklayın.
- Htt-floresan protein füzyonlarından içsel floresan görüntülüyorsa, en iyi sinyal için beyinleri 24 saat içinde görüntüleyin.
4. Agregaların Prion Benzeri İletiminin Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi
- Seçilen Gal4 ve QF sürücülerinin ifade edildiği beyin bölgesi boyunca z-dilimi görüntüleri toplamak için 40X veya 60/63X yağ objektifi ile donatılmış konfokal bir mikroskop kullanarak monte edilmiş beyinleri görüntüleyin (Şekil 2A, B).
- Uygun lazerleri kullanarak floresan protein füzyonlarını veya immün etiketli proteinleri uyarın (ör., GFP / YFP / FITC için 488 nm veya mCherry / Cy3 için 552 nm). Spektral bir algılama sistemi veya her bir florofora özel bant/uzun geçiren emisyon filtreleri kullanarak kanal çapraz konuşmasını ortadan kaldırırken maksimum floresan sinyali yakalayan algılama pencerelerini ayarlayın.
NOT: Protein agregatlarını görüntülerken dikkatli olun. Her bir agreganın merkezindeki piksellerin, özellikle daha büyük agregalarda doygun hale gelmesi kolaydır. Görüntüdeki doygunluğu en aza indirmeye çalışın, ancak daha küçük kümelenmiş türlerden sinyal kaybetme riskinin farkında olun (Şekil 2B, C, D). Çok fazla doygunluk, görüntü arka planını artıracak ve izole punktaları tanımlamayı zorlaştıracaktır. Her veri setindeki son görüntüleri çekmeden önce optimize etmek için farklı görüntüleme ayarlarını test edin.
- Verileri, tek tek z dilimleri arasında hareket ederek (örneğin, Şekil 2C ve Şekil 4A) veya konfokal dilimleri 3 boyutta oluşturduktan sonra (Şekil 3A, B) manuel olarak ölçerek analiz edin.
not: Bu, Image J veya başka bir görüntü işleme yazılımında yapılabilir.
- Agregalar iyi ayrılmışsa ve minimum arka plan floresansı varsa, konfokal yığının 3B rekonstrüksiyonunda agregaları farklı "nesneler" veya "yüzeyler" olarak sistematik olarak tanımlamak, ölçmek ve analiz etmek için görüntü analiz yazılımı kullanın (Şekil 3B).
not: Açıklanan yazılım eylemleri, burada kullanılan cihaza ve yazılıma özgüdür (bkz. Malzeme Tablosu).
- Konfokal bir z serisini 3D görüntüleme modunda görselleştirin. Seçilen bir kanaldaki tek tek noktaları tanımlamak için "Analiz" sihirbazını kullanın (örneğin, Şekil 3'teki HttQ91-mCherry agregaları için kırmızı kanal). Eşiklemeyi ve filtreleri, görüntüdeki tek tek nesneler olarak tüm heterojen boyutlu toplamaları doğru bir şekilde temsil edecek şekilde ayarlayın.
- Yazılım algoritması tarafından anormal bir şekilde birleştirilen yakından ilişkili toplamaları ayırmak için "İkili İşleme Ön Filtresi" altında "Nesneleri Böl"ü etkinleştirin. Nesnelerin toplam sayısının ve bunlarla ilişkili ölçümlerin "Ölçümler" altında bildirildiğini unutmayın.
not: Mutant Htt agregatlarının miktarını belirlemek için kullanılan bu yöntem, immün boyama protokolüne uygun değildir, çünkü amiloid agregatlarının merkezi antikorlara karşı aşılmazdır. Sonuç olarak, agregalar mikroskopta halka benzeri yapılar olarak görünür ve görüntü analiz yazılımı bu bireysel "noktaları" doğru bir şekilde tanımlayamaz ve ayırt edemez.
- Vahşi tip Htt agregalarını, z yığınında manuel olarak hareket ederek ve vahşi tip Htt agregalarını puanlayarak, birden fazla dilimde görünmeleri durumunda hiçbir agreganın çift puanlanmamasını sağlayarak nicelleştirin (Şekil 4A).
not: Bu manuel niceleme yaklaşımı, her bir konfokal yığındaki agrega sayısı makul olduğunda (örneğin, 20-50) kullanılabilir. Görüntü analiz yazılımı, tek tek punktaları aynı kanaldaki çevredeki sinyalden (örneğin, yakındaki hücrelerdeki dağınık vahşi tip Htt'den gelen sinyal) ayırt edemediğinde de yararlıdır (Şekil 2B, C ve Şekil 4A). Vahşi tip Htt agregatlarının ölçülmesi de zor olabilir, çünkü beyindeki birçok normal yapı noktasal görünür (örneğin, hücre süreçleri ve sinapslar). Vahşi tip ve mutant Htt sinyallerinin birlikte lokalizasyonu bir seçim kriteri olarak kullanılabilir; bununla birlikte, bazı mutant Htt "tohumlarının" konfokal tespit sınırının altına düşmesi mümkündür. Alıcı hücrelerde toplanmayan Htt dışında bir protein (örneğin, GFP), beyindeki ilgisiz noktasal yapıları etiketlemek için kullanılabilir.
- Tek tek agregaların daha fazla karakterizasyonunu gerçekleştirmek için görüntü analiz yazılımı kullanın. Örneğin, agregaların boyut dağılımını (Şekil 3C), mutant ve vahşi tip Htt proteinleri arasındaki yüzde ko-lokalizasyonu (Şekil 4A) belirleyin veya FRET kullanarak protein-protein etkileşimlerini doğrudan ölçün (Şekil 4B).
- Belirli bir kanaldaki tüm görünür agregaları doğru bir şekilde tanımlayan bir nokta veya yüzey algılama algoritması kullanarak tek tek punktaların boyut dağılımını belirleyin. Noktaların veya yüzeylerin ilgili ölçümlerini almak için görüntü analiz yazılımını kullanın, örneğin adım 4.2.1.
'da açıklanan yazılım "Analiz" sihirbazındaki "Ölçümler" bölümünden 'agrega çapı' (Şekil 3C), 'hacim' veya 'yoğunluk' bilgilerini elde edin
not: Şekil 3C'de, tek bir DA91 glomerulusunda tanımlanan tüm HttQ1-mCherry puncta için çapların dağılımını rapor ediyoruz.
- HttQ25-YFP ve HttQ91-mCherry agregaları arasındaki ortak lokalizasyon yüzdesini, konfokal bir z-yığını boyunca dilim dilim manuel olarak hareket ettirerek belirleyin (en doğru yöntem). Ancak, herhangi bir agregayı iki kez saymamaya dikkat edin. Bunu önlemek için, yalnızca odak düzlemi agreganın merkezinden geçiyorsa belirli bir z dilimindeki agregaları sayın (Şekil 4A).
- Alıcı fotoağartma yöntemini kullanarak kolokalize HttQ91-mCherry sinyali ile indüklenmiş HttQ25-YFP agregaları için FRET verimliliğini hesaplayın.
- İlk olarak, diğer kanalda sinyal üretmeyen yalnızca mCherry ve yalnızca YFP sinyalleri için algılama pencereleri oluşturarak YFP ve mCherry kanalları arasındaki olası çapraz konuşmayı ortadan kaldırın. Bu ayarları kullanarak, tek tek HttQ25-YFP puncta'nın ve bunlarla ilişkili HttQ91-mCherry sinyalinin 'önceki görüntüsünü' alın ( Şekil 4B).
- Ardından, kırmızı lazeri (örn. 552 nm) %100 yoğunluğa ayarlayarak mCherry sinyalini fotoağartın ve sinyal gidene kadar tarayın. 'Önceki görüntü' için kullanılan ayarlara geri dönün ve aynı noktanın 'sonraki görüntüsünü' alın (Şekil 4B).
- Görüntü analiz yazılımını kullanarak foto ağartma öncesi ve sonrası her punktum için floresan yoğunluğu ölçümlerini hesaplayın.
- 'Önceki görüntüde' (YFPinitial) ölçülen YFP donör floresansını 'sonraki görüntüdeki' (YFPfinal) YFP donör floresansından çıkararak FRET verimliliğini hesaplayın. Bu değeri YFPfinal'e bölün ve 100.
ile çarpın
not: FRET verimliliği, her HttQ25-YFP toplamı için piksel piksel veya genel olarak hesaplanabilir (Şekil 4B). Alıcı foto ağartma, her bir HttQ25-YFP punctum ile ilişkili mCherry sinyali, mCherry foto ağartma işleminden sonra saptanabilir YFP dequenching üretmek için yeterince yüksek olduğunda, FRET verimliliğini hesaplamak için özellikle yararlı bir tekniktir.
