Method Article

Genetiği Değiştirilmiş Drosophila Beyinlerinde Protein Agregatlarının Görüntülenmesi ve Miktarının Belirlenmesi

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Donnelly, K. M., et al. Drosophila Melanogaster'de Prion Benzeri Protein Agregatlarının Hücreden Hücreye İletiminin İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, genetiği değiştirilmiş Drosophila beyinlerindeki protein agregatlarının görüntülenmesini ve miktarının belirlenmesini göstermektedir. Beyinler sabitlenir, yıkanır ve montajdan önce solma önleyici bir madde ile muamele edilir. Görüntüler konfokal bir mikroskop kullanılarak yakalanır ve mutant protein agregatlarının iletimini gözlemlemek için nicelleştirilir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Drosophila'da Gal4 ve QF Aracılı Htt Transgen Ekspresyonunun Birleştirilmesi

  1. Dokuya özgü Gal4 veya QF "sürücüleri" içeren transgenik Drosophila melanogaster hatlarının yanı sıra Gal4-UAS veya QF-QUAS'ın akış aşağısında vahşi tip veya mutant Htt transgenleri içeren hatları toplayın ve / veya oluşturun. Bu transgenlerden eksprese edilen proteinlerin, aynı sinekte mutant ve vahşi tip Htt transgen ürünlerinin farklılaşmasına izin vermek için floresan proteinlere veya epitop etiketli olduğundan emin olun. Bkz. Şekil 1.
    NOT:     Tipik olarak insan Htt geninin ekzon 1 fragmanlarını kullanırız. Bununla birlikte, istenirse da....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1. QF-QUAS ve Gal4-UAS ikili ekspresyon sistemlerini kullanarak mutant ve vahşi tip Htt transgenlerinin birleştirilmiş ekspresyonu için genetik bir yaklaşım. "A hücresinde", patojenik uzunlukta bir poliQ gerilmesi (Q91) içeren mCherry etiketli mutant Htt proteini, dokuya özgü bir promotör A'nın ("PA") aşağı akışında bulunan bir QF sürücüsü kullanılarak ifade edilir. "B hücresinde", normal bir po.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Fosfat tamponlu salin (PBS), 10X, pH 7.4ThermoFisher BilimselAM96251X'e seyreltin
Triton X-100Sigma-AldrichT9284-1L
KimmendilThomas Bilimsel2904F24
%20 paraformaldehit (PFA)Elektron Mikroskobu Bilimleri15713-S
Normal Keçi Serumu (NGS), filtrelenmişLampire Biyoloji Laboratuvarları7332500Aliquot ve aldıktan sonra dondurun
Tavuk anti-GFPAves LaboratuvarlarıGFP-10201:500 seyreltmede kullanın
Tavşan anti-DsRedClontech teknolojisi6324961:2000 seyreltmede kullanın; DsRed bazlı floresan proteinleri tanıyabilir (ör. mCherry, mStrawberry, tdTomato, vb.)
Fare anti-BruchpilotGelişim Çalışmaları Hibridoma BankasıNC821:100 seyreltmede kullanın; sinek beyni boyunca aktif pre-sinaptik yapıları işaretleyecektir
FITC anti-tavukThermoFisher BilimselSA1-72001:250 seyreltmede kullanın
Alexa Fluor 568 tavşan önleyiciYaşam TeknolojileriA110111:250 seyreltmede kullanın
Alexa Fluor 647 anti-fare antikoruYaşam TeknolojileriA212351:250 seyreltmede kullanın
Slowfade Altın Antifade ReaktifiYaşam TeknolojileriS36936 Serisi
Mikroskop Slaytları (25 x 75 x 1.0 mm)Balıkçı Bilimsel12-550-143
Kapak Camı (22 x 22 mm)Küre Bilimsel1404-15
Dumont Biyoloji Sınıfı Forseps, Stil 3Ted Pella'nın fotoğrafı.503Baskın olmayan elde kullanım
Dumont Biyoloji Sınıf Forseps, Stil 5Ted Pella'nın fotoğrafı.505Baskın elde kullanım
LAS X görüntü analiz yazılımıLeica Belediyesi
Imaris görüntü analiz yazılımıBit düzlemi
Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregatesDrosophila BrainsConfocal MicroscopyImage QuantificationFluorescent TaggingCo localization AnalysisFixative SolutionAntifade ReagentZ stack ImagingMutant Protein

Related Articles