Reaktif Astrogliozu İndüklemek için Bir Fare Modelinde Kortikal Bıçak Yaralanması Oluşturma

Özet

Kaynak: Allahyari, R. V. et al. Ön Beyin Bıçak Yaralanması ile İn Vivo Reaktif Gliozis Tetikleme. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, farelerde kafatasına maruz kalma ve beyin lezyonu oluşturmayı içeren kortikal bıçak yaralanması prosedürünü göstermektedir. CNS travmasını, inflamasyonunu ve onarım mekanizmalarını incelemek için astrositlerin nöroprotektif bir tepkisi olan reaktif astrogliozu indükler.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Fareyi Ameliyata Hazırlama

1. Fareyi ev kafesinden çıkarın ve tartın (g).
2. Fareyi bir izofluran indüksiyon odasına yerleştirin ve yaklaşık 3-5 dakikalık bir cerrahi anestezi düzlemi oluşturmak için oksijeni 2 L / dk'ya ve izofluran buharlaştırıcıyı 5'e ayarlayın. Yavaş solunum ve immobilizasyon için monitör. Ayak parmağını kıstırma refleksini kullanarak farenin tamamen sakinleştirilip yatıştırılmadığını kontrol edin.
3. Fare tamamen sakinleştirildiğinde, stereotaksik bir çerçeveye yerleştirin ve burnu, izoflura boru ile tutturulmuş olan burun konisine sabitleyin. Kulak çubuklarını kulak kanalına yerleştirin ve başın sabit olduğundan emin olarak sıkın.
4. Başı kulaktan kulağa ve gözlerin arasından kulakların arkasına kadar tıraş edin.
5. Cildi, her biri 3 kez olmak üzere alternatif izopropil alkol ve betadin iyot çözeltisi mendilleriyle sterilize edin.
6. Cerrahi işlem sırasında kurumasını önlemek için her iki gözünüze de suni gözyaşı uygulayın.

2. Cerrahi İşlem

1. Ayak parmağını veya kuyruğu sıkıştırarak anestezi derinliğini izleyin. Fare, yanıt alınmadığında ve solunum yavaş ve eşit olduğunda uygun cerrahi düzlemdedir.
2. 11 No'lu bir neşter bıçağı kullanarak tek ve sıkı bir hareketle gözlerin hemen arkasından neredeyse kulakların arasına kadar parasagital bir cilt kesisi yapın. Cildi bir kenara çekin ve sağ tarafı kanama durdurucu ile klipsleyin.
3. 11 No'lu neşterin ve pamuk uçlu aplikatörlerin donuk tarafını kullanarak üstteki zarın kafatasını temizleyin. İsteğe bağlı olarak, kafatasını %0.9 tuzlu su çözeltisine batırılmış pamuk uçlu bir aplikatör ile silin. Tamamen kurumasını bekleyin.
4. Küçük bir cetvel kullanarak, kraniyotominin ön sınırını koronal sütürün 1 mm kaudalinde ve kraniotominin sol kenarını sagital sütürün 1 mm lateralinde kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin (Şekil 1). Daha sonra kraniotominin sağ ve kaudal sınırlarını sırasıyla sagital ve koronal sütürlerden 4 mm uzakta işaretleyin (Şekil 1).
5. 0,5 mm'lik bir matkap ucu kullanarak, kalıcı işaretleyici taslağını takip ederek yavaşça delerek kraniyotomi yapmaya başlayın. Kafatasını tamamen kırmadığınızdan emin olun. İzole edilmiş parietal kemik parçasına 5 numaralı forseps ile hafifçe bastırın, zayıflık alanları basınca yol açacaktır. İnceltilmiş kemik çevre boyunca yeterince zayıf olduğunda, kemik parçası çıkarılmaya hazırdır.
   not: Araştırmacı kemiği tek parça halinde çıkarmakta zorluk çekiyorsa, bu, delme sırasında kemiğin yeterince incelmediğini gösterir. Kemik parçasının kolayca çıkarılmasını kolaylaştırmak için sonraki hayvanlarda kafatasını daha fazla delmeyi düşünün.
6. 23 G'lik bir iğne ile donatılmış 10 ml'lik bir şırınga kullanarak, izole edilmiş kemiği ve delinmiş alanı ıslatmak için az miktarda% 0.9 salin uygulayın.
7. Manipülatör kolunu stereotaksik ekipmana takın. Yeni bir No. 11 neşter bıçağını, bıçağın keskin tarafı rostrally bakacak şekilde prob tutucusuna takın.
   not: Rostral ve kaudal dokular sırasıyla bıçağın keskin ve künt kenarlarını deneyimlese de, penetran yaralanmanın neden olduğu mekanik hasar lezyonun kapsamı boyunca karşılaştırılabilir. Rostral ve kaudal bölümler arasında GFAP ekspresyonunun yukarı regülasyonu veya proliferasyonu dahil olmak üzere reaktif gliozisin ana özelliklerinde kayda değer bir fark gözlemlemedik.
8. Manipülatör kolunu yoldan uzak tutarak, 5/45 açılı forseps kullanarak izole kemiği dikkatlice kaldırın. Forsepsin ucunu izole kemiğin yan tarafına yerleştirin ve geride kalan kemik parçasını tek bir tam hareketle çekmek için kaldıraç kullanarak kaldırın.
   not: Beyni bıçaklamamaya veya kafatasının altındaki durayı rahatsız etmemeye dikkat edin.
9. Islatılmış emilebilir jel köpüğünden küçük bir parça alın ve kurumasını önlemek ve mevcut olabilecek kanı emmek için üstü açık beynin üzerine yerleştirin.
10. Jel köpük yerine oturduktan sonra, manipülatör kolunu yerine çevirin ve bıçağı jel köpüğün üzerindeki kraniyotominin merkezine ayarlayın. Jel köpüğü çıkarın ve bıçağı, durayı delmeden uç duraya değene kadar indirin. Stereotaksikin dikey kolundaki vernier ölçeğini kullanarak dorsal / ventral koordinatları işaretleyin.
11. Manipülatörün kolunu kullanarak, bıçağı yavaşça beynin içine tam olarak 3 mm indirin. Bu, manipülatör kolundaki sürmeli ölçek işaretleri kullanılarak elde edilir. Bıçağın 5-10 saniye yerinde kalmasına izin verin. Bıçak eki rostral ile stereotaksik kolu üç kez kaudal konuma getirin ve bıçağın karşı uca hareket etmeden önce kraniyotominin rostral ve kaudal sınırlarına ulaşmasına izin verin.
    not: Bıçak yerleştirilmeden önce dura çıkarılmaz. Kalınlığı ~80 μm olan sıçan durasının aksine7, fare durası önemli ölçüde daha incedir (sadece birkaç hücre katmanı kalınlığındadır) ve yerleştirme sırasında neşter bıçağına karşı kayda değer bir direnç oluşturmaz. Her hayvanın tutarlı bir şekilde yaralanmasını sağlamak için her fare için yeni bir neşter bıçağı kullanın.
12. Bıçağı beyinden çıkararak stereotaksik kolu yavaşça kaldırın. Bıçağı çıkardıktan sonra, fazla kan veya sıvıyı emmek için hemen beyin yüzeyine başka bir jel köpük parçası yerleştirin.
13. Bu arada stereotaksik kolu çıkarın ve 11 numaralı neşter bıçağını atın. Kanama durduktan sonra jel köpüğü çıkarın.
14. Etilon veya prolen gibi emilmeyen dikişlerle cildi dikerek yarayı kapatın. Dikişler ameliyattan 9-10 gün sonra alınmalıdır.
15. Fareyi ev kafesine geri koyun ve farenin bir ısıtma yastığı üzerinde yavaşça iyileşmesine izin verin ve herhangi bir sıkıntı belirtisi olup olmadığını izleyin. İzofloranın neden olduğu anesteziden iyileşme tipik olarak izoflorandan çıkarıldıktan sonra 2-5 dakika içinde gerçekleşir. Sternal yaslanma kabiliyetini yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın.
16. Hidrasyonu sağlamak için 0.5-1 ml laktasyonlu Ringer solüsyonunu deri altına uygulayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Kraniotomi alanını gösteren fare kafatasının şeması. Mavi çizgiler, delinecek alanın sınırlarını belirleyen ilk işaretleri gösterir. Üst ve sol izler sırasıyla koronal veya sagital sütürlerin 1 mm altında veya lateralinde ölçülür. Alt ve sağ işaretler koronal ve sagital sütürlerden sırasıyla 4 mm'de ölçülür. Kraniyotomi, işaretli sınırlar (noktalı çizgi) içinde bir daire delinerek gerçekleşti...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Stereovergi	Harvard Aygıtı	726049
Yüksek hızlı mikro matkap	Harvard Aygıtı	724950
paslanmaz çelik neşter bıçağı, # 11	MedVet (Veteriner Hekim	JOR581S
5/45 açılı forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-35
Jelköpük sünger 12cmx7mm	balıkçı	NC9841478
Antikorlar ve diğer reaktifler	Üretici	Katalog Numarası	Seyreltme (parlak alan) Seyreltme (floresan)
Rb anti-GFAP	DAKO	Z033429-2	1:20k 1:1k
Shp anti-BrdU	Abcam Belediyesi	AB1893	1:2k 1:500
Biyotinile keçi anti-tavşan	Vektör Laboratuvarları	BA-1000	07:40
Biyotinile tavşan anti-koyun	Vektör Laboratuvarları	BA-6000	07:40
Alexafluor 488 keçi anti-tavşan	Yaşam Teknolojileri	A-11008	07:40
Alexafluor 568 eşek anti-koyun	Yaşam Teknolojileri	A-21099	17:40
DAPI Nükleik Asit Lekesi	Yaşam Teknolojileri	D3571	17:40
Kresil Menekşe Asetat	Sigma Aldrich	C5042-10G	%1