Listeria monocytogenes Enfeksiyonunu Takiben Bir Fare Beyninde Bakteriyel Kolonizasyonun Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Ghosh, P., et al., Listeria monocytogenes Beyin Enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, Listeria monocytogenes ile enfekte olmuş perfüze fare beyninden enfektif bakteri yükünün niceliğinin ölçülmesini göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Organ Toplama ve Bakteri Yüklerinin Belirlenmesi

1. Perfüzyonu takiben, bağlı herhangi bir damar sistemini ve bağları dikkatlice çıkararak ve organları ayrı ayrı 5 mL steril soğuk (4 ° C) PBS içeren steril 15 mL konik bir tüpe yerleştirerek organları (örneğin karaciğer, dalak) hasat edin. Daha fazla işlem gerçekleşene kadar numuneleri buz üzerinde saklayın.
2. Beyni toplamak için, makas kullanarak kulakların arkasındaki başın başını kesin ve kafa derisini hayvanın gözleri arasında orta hatta doğru kesin. Gerekirse, makası kafatasına bastırarak fazla dokuyu kesin.
   1. Makasın bir ucunu yavaşça foramen magnum'a (omuriliğin geçtiği kafatasının tabanındaki delik) sokun ve her iki taraftan kafatasına yanal olarak kesin.
   2. Kafatasını kemirgenin gözleri arasında orta hatta doğru nazikçe kesin ve yanal baskı uygulayın. Beyni rahatsız etmekten kaçının ve beyin dokusu ile makas arasında minimum teması koruyun.
   3. İnce uçlu forseps kullanarak, beyni açığa çıkarmak için kafatasını açın ve beyni çıkarmak için beynin alt tarafı ile kafatasının tabanı arasına bir spatula yerleştirin.
      not: Bu, beyin sinir liflerinin yırtılmasına neden olur.
   4. Beyni, 5 mL steril soğuk PBS içeren 15 mL'lik konik bir tüpe dikkatlice aktarın.
   5. Fare karkasını atın ve kalan hayvanlar için bu adımları tekrarlayın.
      not: Tüm organlar toplandıktan sonra, işlem alanını temizleyin ve bakteri yüklerini belirlemek için organ homojenizasyonuna hazırlanın.
3. Biyogüvenlik kabinine yerleştirilen bir doku homojenizatörünün ucunu, her biri ayrı bir 15 mL konik tüp içinde bulunan %5 çamaşır suyu, steril su, %75 etanol ve steril su içinde sırayla 10 saniye boyunca çalıştırarak temizleyin ve sterilize edin.
4. Enfekte olmuş beyni (ayar 6'da ~ 20 s, maksimum rpm) 15 mL konik tüpte görünür doku parçası kalmayana kadar homojenize edin.
   1. Bir sonraki organ numunesine bakteri taşınmasını önlemek için homojenizatörü adım 1.3'te açıklandığı gibi temizleyin.
   2. Diğer tüm organlar (örn. karaciğer, dalak) için homojenizasyon işlemini gerçekleştirin.
   3. Homojenizasyon işlemi tamamlandıktan sonra, homojenizatörü adım 1.3'te anlatıldığı gibi temizleyin ve daha fazla kullanılana kadar saklayın.
5. Steril PBS'de organ homojenatlarının 10 kat seri dilüsyonlarını hazırlayın ve organ başına CFU'yu belirlemek için dilüsyonları BHI agar / streptomisin plakaları üzerine plakalayın.
   NOT: Kanın mL başına CFU'sunu belirlemek için benzer bir yöntem uygulanır.
   1. Tüm seyreltmeler kaplandıktan sonra, plakaları gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre aktarın.
   2. Ertesi gün, organ veya mL kan başına toplam bakteri sayısını belirlemek için her plakadaki koloni sayısını aşağıdaki gibi sayın:
      CFU/organ = (koloni sayısı x seyreltme faktörü) / mL homojenat kaplama x 5
      CFU/mL kan = (koloni sayısı x seyreltme faktörü) / mL kan kaplaması

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Beyin Kalp İnfüzyon ortamı	Becton Dickinson'ın fotoğrafı.	237200
Streptomisin sülfat	Amresco Belediyesi	0382-50G
Petri kapları	VWR (VWR)	25384-342
Gliserol	VWR (VWR)	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Temel Homojenizatör	İKA	3352109	Modeli: T18BS1
Spektrofotometre	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	DU 800 serisi
BALB/c fareler	Jackson Laboratuvarı	Model #000651
Etilendiamintetraasetik asit	Sigma-Aldrich	60004
15 ml konik tüpler	VWR (VWR)	21008-918
Fosfat tamponlu tuzlu su	Corning	46-013-CM
Paslanmaz çelik spatula	VWR (VWR)	82027-520
Paslanmaz çelik makas (4,5 inç)	VWR (VWR)	82027-578
Paslanmaz çelik ince uçlu forseps (6 inç)	VWR (VWR)	82027-406

Gazetesi