$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. İmmünofloresan protokolü
- Doku diseksiyonu
- Zebra balığını buzlu suya batırarak kurban edin (5 ölçü buz / 1 ölçü su, 4 °C); hipoksi ile ölümü sağlamak için tüm hareketler duruncaya kadar bırakın.
- Kafayı bir jiletle çıkarın. Forseps ile kafatasının ventral tarafındaki yumuşak dokuyu çıkarın. Kafatasını açın ve kemiği beynin ventral tarafından çıkarın. Beynin sırt tarafından deri ve kafatası kemiklerini çıkarın. Beyni çıkarın.
- Doku fiksasyonu
- Beyni 4 ° C'de% 4 paraformaldehit (PFA) içinde 3 saat daldırarak sabitleyin.
- 1.755 g NaH2PO4H2O ve 4.575 g Na2HPO4 450 mL damıtılmış suda (dH2O) çözerek 0.1 M fosfat tamponu (PB) hazırlayın ve gerekli miktarda NaOH 1N ile 7.4 pH'a ayarlayın.
- 4 g PFA'yı 100 mL 0.1 M PB (pH 7.4) içinde bir ısı plakası üzerinde çalkalayarak çözerek% 4 PFA hazırlayın. 60 ° C'lik bir sıcaklığa ulaşıldığında, berrak bir çözelti elde etmek için 2-4 damla NaOH 1N ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) PFA% 4 bıraktı ve pH'ı kontrol edin. PH'ı 7.4.
'ye ayarlayın
not: Fiksasyon süresi doku boyutuna bağlıdır. 4-6 saatten fazla doku fiksasyonu, antijenleri maskeleyen ve antikor-epitop bağlanmasını sınırlayan aşırı fiksasyona yol açabilir.
- Doku gömme
- Dokuları 3x 5 dakika boyunca 0.1 M PB (pH 7.4) ile durulayın.
- Kriyoproteksiyon için, dokuları PB'de (0.1 M, pH 7.4) %20 sükroza aktarın ve gece boyunca 4 °C'de tutun. Daha sonra, dokuları 0.1 M PB'de (pH 7.4) %30 sükroza aktarın ve 4 ° C'de bir gece daha tutun.
- Dokuları optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği bloğuna gömün. Bunu yapmak için, küçük bir sıvı nitrojen dewar hazırlayın, alüminyum folyo alın ve bir tava oluşturmak için ikiye bölün. OCT bileşiği ile doldurulmuş dokuları içeren tava, OCT bileşiği soğuyana kadar sıvı nitrojene daldırılmalıdır. Dondurulan dokular -80 °C'de kesit alınana kadar saklanabilir.
- Doku kesme
- Donmuş doku bloklarını -20 °C'de bir kriyostata aktarın ve 10 μm'lik koronal veya sagital kesitlerde kesin.
- Dokuları alternatif seri kesitler halinde immünohistokimyaya uygun yapışkan cam slaytlara toplayın ve -20 °C'de kullanana kadar saklayın.
not: -20 °C ile 4 °C arasındaki slaytları karanlık bir slayt kutusunda veya slayt kitabında saklayın.
- Spesifik olmayan bağlanma bölgelerinin bloke edilmesi ve doku geçirgenliği
- Slayttaki doku alanını solvente dayanıklı bir kalemle sınırlayın.
- Bölümleri 3x 5x'i her biri 0.1 M PB (pH 7.4) ile 5 dakika durulayın.
- Hücre zarını geçirgen hale getirmek ve spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için kesitleri geçirgenlik tamponu PB-Triton X-100 %0.3 (PB-T) içinde çözülmüş %1 normal eşek serumu ile RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Triton X-100'ü% 0.3 hazırlayın, 0.3 mL Triton X-100'ü 100 mL 0.1 M PB (pH 7.4) içinde çözün.
- % 1 normal eşek serumunu% 0.3 TritonX-100.
içeren PB içinde çözerek bloke edici çözeltiyi hazırlayın
not: Permeabilizasyon ve bloke edici tamponlarda kullanılan serumun hayvan türü, ikincil antikorun konakçısına bağlıdır.
- Primer antikorların karışımı ile inkübasyon
- Bölümleri 3x 5x'i her biri 0.1 M PB (pH 7.4) ile 5 dakika durulayın.
- Kesitleri, PB-T içinde seyreltilmiş birincil antikorların bir karışımı ile RT'de nemli bir kutuda gece boyunca inkübe edin. Aşağıdaki primer antikor karışımları kullanılabilir: 1:100 oranında seyreltilmiş oreksin reseptörüne (OX-2R) karşı keçi antikoru / 1:100 oranında seyreltilmiş kannabinoid reseptörüne (CB1R) karşı tavşan antikoru veya oreksin peptidine (OX-A) karşı keçi antikoru 1:100 oranında seyreltilmiş/1:100 oranında seyreltilmiş CB1R'ye karşı tavşan antikoru
.
- İkincil antikorların karışımı ile inkübasyon
- Bölümleri 3x 5x'i her biri 0.1 M PB (pH 7.4) ile 5 dakika durulayın.
- Bölümleri RT'de 2 saat boyunca 1) eşek anti-tavşan Alexa Fluor 488-konjuge ikincil antikor ve eşek anti-keçi Alexa Fluor 594-konjuge ikincil antikorun bir karışımı ile 1:100 PB-T'de inkübe edin; veya 2) eşek anti-keçi Alexa Fluor 488-konjuge ikincil antikor ve eşek anti-tavşan Alexa Fluor 594-konjuge ikincil antikorun bir karışımı PB-T.
not: Aynı hayvan konakçısında geliştirilen ikincil antikorları kullanın. Normal serum, aynı ikincil antikor türüne ait olmalıdır (örneğin, eşek ve eşek normal serumunda geliştirilen ikincil antikorları kullanın). Hücre geçirgenliğini artırmak ve arka planı azaltmak için birincil ve ikincil antikorları deterjan içeren bloke edici tampon ile seyreltin.
- Doku montajı
- Bölümleri 3x 5x'i her biri 0.1 M PB (pH 7.4) ile 5 dakika durulayın.
- Bölümleri, 1.5 μL DAPI'yi (1 mg / mL) 3 mL PB içinde çözerek hazırlanan nükleer boya DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) ile boyayın.
- Montaj ortamı ile lamel kızakları (bkz. Malzeme Tablosu). Bu sulu montaj ortamı, doku örneğini stabilize eder ve uzun süreli kullanım için lekeler. Floresan numuneler karanlıkta 4 °C'de saklanabilir. Floroforların ömrünü uzatmak için bir antifade montaj ortamı kullanın.
not: İyi bir montaj ortamı seçin. Montaj maddelerinin en önemli parametrelerinden biri, camın kırılma indisi olan 1.5 civarında olması gereken kırılma indisidir (nD). Burada kullanılan montaj ortamı, özellikle enzim ve lipid tayinleri için hazırlanan numunelerle (yani, artan bir alkol serisi ile kurutulmaması gereken numune) kullanılabilir.
- Denetim
- Birincil veya ikincil antikoru atlayarak veya belirli adımda birincil veya ikincil antiserumları PB ile değiştirerek (negatif kontrol) bölüm 1.1-1.8'i tekrarlayın.
- Bölüm 1.1-1.8'i tekrarlayın, her bir birincil antikoru fazla miktarda nispi peptit (100 mg peptit / 1 mL seyreltilmiş antiserum) ile önceden emin.
- Fare beyninin dilimlerinde 1.1–1.8 bölümlerini tekrarlayın (pozitif kontrol).
not: Başlamadan kısa bir süre önce tüm tamponları taze olarak hazırlayın. Bölümlerin etrafında bir pipet veya filtre kağıdı ile her adımda fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın ve bölümü her zaman nemli tutun.