FITC ve FITC-Ferritin'in Geçirgenliğinin İn Vitro Kan-Beyin Bariyeri Modeli ile İncelenmesi

Özet

Kaynak: Fiandra, L., et al. Bir Sıçan Kan-Beyin Bariyeri Boyunca FITC Yüklü Ferritinlerin İn Vitro Geçirgenliği: Nanoformüle Edilmiş Moleküllerin Dağıtımını İncelemek İçin Bir Model. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, serbest FITC ve FITC yüklü ferritin ile bir zar eki üzerinde astrositler ve endotel hücreleri kullanılarak in vitro kan-beyin bariyeri (BBB) modeli aracılığıyla nüfuzu incelemek için bir yöntem gösterilmektedir. FITC-ferritin, endotel hücreleri üzerindeki reseptörlere bağlandı ve membran bariyerini alt odaya geçerken, serbest FITC sınırlı geçirgenlik gösterdi ve üst odacıkta kaldı.

Protokol

1. BBB Modelinin Kurulması

Not: Kan-beyin bariyeri (BBB) modelini oluşturmak için, piyasada bulunan birincil sıçan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinin (RBMEC'ler) ve sıçan kortikal astrositlerinin (RCA'lar) kullanılmasını öneririz. Tüm adımlar, steril reaktifler ve laminer akış başlığında işlenen tek kullanımlık malzemelerle gerçekleştirilmelidir.

1. Hücre Kültürü
   1. RCA'ların veya RBMEC'lerin bağlanmasını teşvik etmek için sırasıyla poli-L-lizin 100 μg/ml (oda sıcaklığında 1 saat, RT) veya fibronektin 50 μg/ml (37 °C'de 1 saat) ile hücre kültürü şişelerini kaplayın. Daha sonra, %5 fetal sığır serumu, %1 endotel hücre büyüme takviyesi ve %1 penisilin / streptomisin (sECM) ile desteklenmiş endotel hücre ortamında 1 x 10⁶ RCA ve 5 x 10⁵ RBMEC'yi çözün. 20 ml sECM'de bir T175 şişesinde tohum RCA'ları ve 10 ml sECM'de bir T75 şişesinde RBMEC'ler.
      Not: RCA'ların ve RBMEC'lerin çözdürme ve tohumlama geçişleri, BBB modeli ile test edilecek deney koşullarının sayısına göre hücre yoğunluğu ve kültürdeki süre açısından ayarlanmalıdır. 1 flakon 1 x 10⁶ RCA ve 1 flakon 5 x 10⁵ RBMEC ile başlayarak, 20 adede kadar BBB yataklı kesici uç elde etmek mümkündür.
   2. Hücreleri nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C ve %5 CO_2'de yaklaşık 6 gün boyunca RCA'lar için yaklaşık %80 ve RBMEC'ler için %90'ın üzerinde birleşene kadar tutun. Tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (tripsin-EDTA) çözeltisi (tripsin 1:250) kullanarak 5 dakika (T75 şişeleri için 1 ml tripsin ve T175 şişeleri için 2 ml) kullanarak hücreleri ayırın. Tripsin aktivitesini sECM (2: 1) ile durdurun, hücre süspansiyonlarını 750 × g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve peletleri 60 ml sECM'de yeniden süspanse edin.
   3. RBMEC'leri 3 T175 şişeye bölün ve eklere tohumlamadan önce 3 gün daha sECM'de kültürleyin. Bir Burker odasında optik mikroskop altında tripan mavisi ile 1: 1 oranında seyreltilmiş bir hücre süspansiyonunu gözlemleyerek toplam canlı RCA sayısını sayın.
2. Ekler Üzerine Hücre Tohumlama
   1. RCA'ların ve BMEC'lerin bağlanmasına izin vermek için 6 çok kuyulu şeffaf ek parçanın polietilen tereftalat (PET) membranının bir tarafına poli-L-lizin 100 μg/mL ve diğer tarafına fibronektin 50 μg/mL uygulayın. PET membran ile teması önlemek için ekleri cımbızla tutun.
      1. Ekleri 6 oyuklu bir plakaya yerleştirin ve üst hazneye fibronektin çözeltisi (en az 500 μl) ekleyin. 37 ° C'de 1 saatlik inkübasyondan sonra, fibronektin çözeltisini çıkarın, ekleri çok kuyulu plakadan çıkarın ve burada zaten kaplanmış ekler için steril bir destek olarak kullanılan 150^cm2'lik bir Petri kabının dibine baş aşağı koyun.
      2. Ek parçanın alt tarafına nazikçe 800 μl poli-L-lizin ekleyin (Şekil 1A'da gösterildiği gibi; RCA tohumlaması olarak adlandırılır) ve çözeltiyi RT'de 1 saat boyunca ekler üzerinde tutun.
      3. Solüsyonu aspire edin ve eklerin RT'de 15-30 dakika kurumasını bekleyin. Ekler artık hücre tohumlama için hazırdır, ancak BBB yapımına devam etmeden önce çok kuyulu plakada 4 °C'de birkaç gün saklanabilir.
         Not: FD40 akı ölçümleri ile BBB oluşumunu doğrulamak için kontrol olarak kullanılacak hücrelerden en az 3 kaplamalı ek parçayı boş tutmayı unutmayın.
   2. Tohum RCA'ları (35.000 / cm²), baş aşağı kesici uç üzerine 800 μl hücre süspansiyonu bırakarak poli-L-lizin kaplı eklerin alt tarafına yerleştirin (Şekil 1A). Hücrelerin zara verimli bir şekilde bağlanmasını sağlamak için RCA süspansiyonunu RT'de 4 saat boyunca ekler üzerinde bırakın.
   3. Artık çözeltiyi aspire edin, ekleri 2 ml sECM içeren kuyucuklara yerleştirin ve çok kuyulu plakayı nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C ve %5_CO2'de tutun ve sECM'yi her 2 günde bir değiştirin.
   4. 3 gün sonra, RCA'lar kesici ucun alt yüzünü kapladığında, aşağıdaki adımları izleyerek RBMEC'leri kesici ucun üst tarafına tohumlayın:
      1. RBMEC'leri T175 şişelerinden ayırın ve adım 1.1.2 ve 1.1.3'te bildirildiği gibi toplam canlı hücreleri sayın.
      2. Tohum RBMEC'leri (60.000 /^cm2) sECM'de (1.000 μl) ekin üst yüzeyine (Şekil 1B), TransEndotelyal Elektrik Direnci (TEER) arka planı olarak kullanılmak üzere sadece astrositlerle birlikte 3 ek bırakarak. Çok kuyulu plakayı standart kültür koşullarına yerleştirin. Sistemi en az 3 gün kültürde tutun, iç ve alt haznedeki sECM'yi 2 günde bir değiştirin.

2. BBB Doğrulaması

1. TEER Ölçümü
   1. Ko-kültürün 3. gününde, BBB taşıyan ekleri 4 ml sECM ile doldurulmuş uygun bir hazneye (kapaklı ve hem hazne hem de kapağın bir çift voltaj algılama ve akım elektrotu içerdiği durumlarda) yerleştirerek TEER'i kontrol edin. Bir epitel dokusu volt / ohmmetreye bağlayın.
   2. Hücre BBB sistemlerinin TEER ölçümleri ile birlikte, BBB'ler ile elde edilen değerlerden çıkarılacak olan RCA'ları taşıyan 3 ekin TEER değerlerini kaydedin. Sonuçları Ω x^cm2 olarak ifade etmek için elde edilen TEER değerlerini ekin yüzeyi (4,2^cm2) ile çarpın.
   3. Ortak kültürün 3. gününden itibaren, TEER'i her gün ölçün. not: TEER'in arttığı bir başlangıç döneminden sonra, kaydedilen değerler en az iki ardışık gün boyunca (genellikle ko-kültürün 5^{. ve 7. günleri arasında}) sabit kalmalıdır. Bu noktada, BBB doğrulamanın ikinci adımı (bölüm 2.2) ve/veya trans-BBB deneyleri için hazırdır.
      Not: Bölüm 2.1'de açıklanan prosedür, aşağıdaki geçirgenlik deneylerine ayrılmış aynı BBB sistemlerinde gerçekleştirilebilir (bölüm 3). Steril koşullar altında çalıştırın.

3. FITC Yüklü Ferritinlerin Trans-BBB Geçirgenliği (FnN)

Not: Escherichia coli'de üretilen ve nanokafeslerde (FnN) bir araya getirilen insan ferritininin (Fn) rekombinant bir varyantı. FnN, floresein izotiyosiyanat (FITC) ile yüklenir ve hem Fn hem de yüklenen moleküllerin konsantrasyonları doğru bir şekilde belirlenir.

1. FITC ve FITC-FnN'nin Trans-BBB Akısı
   1. Aşağıdaki adımlara göre, 7 ve 24 saatlik inkübasyondan sonra serbest boyanınkine kıyasla, doğrulanmış BBB modellerinin üst odasından alt odasına (genellikle ko-kültürün 5. - 7. gününde) FITC-FnN akısını ölçün:
      1. Her formülasyon için en az 6 BBB sisteminin üst haznesine FITC-FnN (50 μg / ml FnN, 1.1 μM FITC) veya eşit miktarda serbest FITC ekleyin, böylece 7 saat sonra en az 3 kesici ucun alt haznesinden 2 ml sECM solüsyonu çekin ve 24 saat sonra diğer 3 ekin alt haznesinden.
      2. Toplanan numunelerin 500 μl'lik floresan yoğunluğunu spektroflorometre ile ölçün (λ_ex 488 nm, λ_em 515 nm, yarık 5).
      3. Aynı analitik parametreleri kullanarak 500 μl ortamı ölçerek sECM arka plan floresansını elde edin. sECM arka plan floresansını tüm FITC veya FITC-FnN floresan değerlerinden çıkarın.
      4. Elde edilen floresan değerlerini, 500 μl sECM içinde çözünmüş serbest veya nanoformüle edilmiş boyanın bilinen konsantrasyonları (yani 6.87, 13.75, 27.5, 55 nM) ile üretilen iki farklı kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak nüfuz eden FITC veya FITC-FnN konsantrasyonunu belirleyin.

Sonuçlar

Şekil 1: Ekler Üzerine Hücre Tohumlama. RCA (A) ve RBMEC (B) tohumlama prosedürü, çok kuyulu plaka eklerinin iki zıt tarafına yerleştirilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sıçan Beyin Mikrovasküler Endotel Hücreleri	Masum	P10308 Serisi	Sprague Dawley sıçan beyin dokusundan izole edildi, birinci geçişte dondurularak saklandı ve donmuş olarak teslim edildi
Kortikal Astrositler	Masum	P10202 Serisi	2 günlük sıçan beyin dokusundan izole edildi, birinci geçişte donduruldu ve donmuş olarak teslim edildi.
Endotel Hücre Ortamı kiti	Masum	P60104 Serisi	ECM (500 ml) ve fetal bovin serumu (25 ml), endotel hücre büyüme takviyesi (5 ml) ve penisilin/streptomisin (5 ml). Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın ve ışıktan koruyun
Fenol Kırmızısı İçermeyen Tripsin-EDTA	Euro Klonu	ECM0920D	Kullanmadan önce 37 °C su banyosunda ısıtın
Floresein izotiyosiyanat-dekstran 40000	Sigma	FD40S Serisi	Işıktan koruyun
Dulbecco'nun Ca ve Mg içermeyen fosfat tamponu tuzlu	Euro Klonu	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
Sığır serum albümini	Sigma	A7906
Keçi serumu	Euro Klonu	ECS0200D
Poli-L-lizin Hidrobromür	Sigma	P1274 Serisi	Aynı çözüm birkaç kez kullanılabilir
Sığır plazmasından fibronektin	Sigma	F1141	Aynı çözüm birkaç kez kullanılabilir
Polietilen tereftalat (PET) ekler	doğan	F3090	Şeffaf Polietilen tereftalat (PET) membranlar; yüzey alanı: 4,2 cm2; gözenek boyutu 0,4 μm/yüzey alanı
T75 Primo TC şişesi	Euro Klonu	ET7076
T175 Primo TC şişesi	Euro Klonu	ET7181
EVOM2 Epitel Dokusu Volt/Ohmmetre	Dünya Hassas Aletler Almanya	EVOM2
Endohm- 24SNAP fincan	Dünya Hassas Aletler Almanya	ENDOHM-24SNAP
Kameralı ışık/floresan mikroskobu	Leica Mikro Sistemler	DM IL LED Fluo / ICC50 W Kamera Modülü	Kameralı canlı hücreler için ters mikroskop
Konfokal Mikroskop	Leica Mikro Sistemler	TCS SPE (Kamu Hizmetleri)

su Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi