Sıçan Beyninin Farklı Hücre Altı Bölmelerinde Proteazom Aktivitesinin Ölçülmesi

1. Proteazom Aktivite Testi

>NOT: Proteazom aktivitesi, 20S Proteazom Aktivite Kitinin biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanılarak homojenize beyin dokusunda ölçülebilir. Bu tahlil, tam 26S proteazom komplekslerinin aktivitesini doğrudan ölçmez. Daha ziyade, 20S çekirdeğinin aktivitesini ölçer, yani tüm 26S proteazom kompleksinin aksine çekirdeğin kendisinin aktivitesini anlamak için yalnızca bir vekil olarak hizmet edebilir. Bu testin başarısı, tekrarlanan donma-çözülme döngüleri ve/veya özellikle iyonik deterjan seviyelerinin artmasıyla azalır ve 360/460 (uyarma/emisyon) filtre setine ve 37 °C'ye kadar ısıtma özelliklerine sahip bir plaka okuyucunun kullanılmasını gerektirir.

1. Plaka okuyucu ayarları: 37 °C'ye kadar önceden ısıtın ve çalışma boyunca tutun.​
   1. Uyarımı 360'a ve emisyonu 460'a ayarlayın. Kullanılan 96 kuyulu plaka boşsa, optik konumunu Alt olarak ayarlayın. Koyu/siyah 96 kuyulu bir plaka kullanılıyorsa, optik konumunu Üst olarak ayarlayın.
   2. Floresan okuma seçenekleri altında eski plaka okuyucu modellerini Otomatik Kazanç olarak ayarlayın; bunun için daha yeni modeller önceden ayarlanmıştır. Her 30 dakikada bir tarama (okuma) ile 2 saatlik bir kinetik çalışma programlayın.
2. Kitte sağlanan 10x tahlil tamponunu 13,5 mL ultra saf su ile sulandırın. Şimdi 1x tampona 14 μL 100 mM ATP ekleyin; Bu, numunelerdeki proteazom aktivitesini önemli ölçüde artırır ve test güvenilirliğini artırır. Son 20S Test tamponu, ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde veya 4 ° C'de saklanabilir ve birkaç ay boyunca stabildir.
3. Kitte sağlanan AMC standardını 100 μL DMSO ile yeniden oluşturun. Standart ışığa duyarlı olduğu için bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında gerçekleştirin.
4. Karanlıkta veya düşük ışık koşullarında yeniden yapılandırılmış standardı kullanarak standart bir AMC eğrisi oluşturun.
   1. Ayrı 0,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde, 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 ve 0 μM AMC konsantrasyonuna karşılık gelen AMC standardının 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 ve 0 μL'sini ekleyin.
   2. Bu tüplere aynı sırayla 84, 92, 93.6, 96.8, 98.4, 99.2, 99.6 ve 100 μL 20S Test tamponu ekleyin. Bu, homojenize numunelerdeki proteazom aktivitesinin plaka okuyucu kalibrasyonu ve analizi için kullanılacak bir dizi yüksek ila düşük AMC konsantrasyonu oluşturur.
   3. Tüm seyreltilmiş standartları ihtiyaç duyulana kadar karanlıkta buz üzerinde saklayın.
5. Kit içinde sağlanan proteazom substratını (Suc-LLVY-AMC) 65 μL DMSO ile sulandırın. Alt tabaka ışığa duyarlı olduğu için bu adımı karanlıkta veya düşük ışık koşullarında gerçekleştirin. 20S Test tamponu kullanarak yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde proteazom substratının 1:20 oranında seyreltilmesini oluşturun. Seyreltilmiş alt tabakayı ihtiyaç duyulana kadar karanlıkta buz üzerinde saklayın.
   not: Örneğin, plakada 10 numune ve 1 boş olacaksa, kuyucuk başına 10 μL'de 22 kuyucuk (kopyalarla birlikte) için yeterli seyreltilmiş substrata ihtiyacınız olacaktır. Bu, pipetleme hataları için 220 μL ihtiyaç + 30 μL'ye eşittir ve 12,5 μL substrat ve 237,5 μL 20S Test tamponu gerektirir.
6. İstenen numuneleri çözün (dondurulmuşsa) ve 96 oyuklu bir plakaya normalleştirilmiş bir miktar ekleyin. Her örneği iki kopya halinde çalıştırın. İhtiyaç duyulan numune miktarı doku hazırlığına göre değişir. Genel olarak, herhangi bir hücre altı fraksiyon için 10-20 μg yeterlidir.
7. Numune kuyusu hacmini ultra saf su ile 80 μL'ye getirin. Eklenen miktar, eklenen numunenin hacmine bağlıdır. Örneğin, numune 1 4.5 μL protein ve numune 2 8.7 μL ise, ihtiyaç duyulan su miktarı sırasıyla 75.5 μL ve 71.3 μL olacaktır. İki ayrı kuyucuğa tek başına 80 μL su ekleyin; bunlar Tahlil Boşlukları olacaktır.
   not: Pipetleme hatalarından kaynaklanan protein hacmindeki değişiklikleri sınırlamak için, protein konsantrasyonları en az konsantre numuneye normalize edilebilir. Bu, her koşulda aynı numune hacminin kullanılmasına izin verecektir.
8. Test Boşlukları da dahil olmak üzere her oyuğa 10 μL 20S Test tamponu ekleyin. Kuyucuklar arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için burada bir tekrarlayıcı/otomatik pipet önerilir.
9. İsteğe bağlı: Bu aşamada, istenirse in vitro manipülasyonlar yapın; bu, her numunenin, araç da dahil olmak üzere, tedavi başına ek 2 kuyuya sahip olmasını gerektirecektir. Eğer öyleyse, numune kuyucuğunun 2'sine 5-10 μL ilaç/bileşik ve diğer 2 kuyucuğa eşdeğer hacimde kontrol/araç ekleyin. Plakayı önceden ısıtılmış plaka okuyucuya veya 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
10. Işıkları kapatın veya karanlık bir odaya girin. 100 μL seyreltilmiş AMC standartlarının tümünü yeni bir kuyuya ekleyin; Her standartta tek bir kuyu bulunacaktır.
11. Karanlıkta, numune ve Test Boşlukları içeren kuyucuklara 10 μL seyreltilmiş proteazom substratı ekleyin, ancak AMC standardına göre değil. Kuyucuklar arasında tutarlı tahlil hacmi sağlamak için burada bir tekrarlayıcı/otomatik pipet önerilir.
12. Plakayı plaka okuyucuya yerleştirin ve kinetik çalışmayı başlatın.
    not: Kinetik çalışma sırasında plakanın sürekli çalkalama altında olması gerekmez, ancak kullanıcı istenirse bunu seçebilir
13. Kinetik çalışmanın sonunda, ham 360/460 floresan değerlerini Microsoft Excel'e aktarın.
    1. Her standart, her numune ve 5 taramanın tümü için Tahlil Boşluğu için yinelenen kuyucukların ortalamasını alın. Ham floresan değerleri, numuneler için yapılan taramalar arasında artmalı, ancak standartlar ve Tahlil Boşlukları için sabit kalmalıdır (veya biraz azalmalıdır).
    2. En yüksek AMC standart kuyu ortalamasını alın ve bilinen konsantrasyona (20 μM) bölün. Standartlaştırılmış AMC değeri elde etmek için bu değeri tahlilde kullanılan numune konsantrasyonuna bölün. Her numune ve Tahlil Boş ortalaması için standartlaştırılmış AMC değerine bölün.
    3. Bu son değeri alın ve her numune için normalleştirilmiş değeri ve Test Boşluğunu elde etmek için tahlilde kullanılan numune konsantrasyonuna bölün. Bunu 5 taramanın tümü için yapın.
    4. 5 taramanın tümü için her normalleştirilmiş örnek değerinden normalleştirilmiş Test Boşluğu değerini çıkarın.