İskemik Fare Beyin Dokularından Hücre Süspansiyonlarının Elde Edilmesi

Özet

Kaynak: Pösel, C., et al. İskemik Fare Beyninden İmmün Hücrelerin İzolasyonu ve Akış Sitometrik Analizi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, inme araştırmalarında inflamasyon tepkilerini incelemek için beyin hücrelerinin ve sızmış bağışıklık hücrelerinin iskemik fare beyin dokularından enzimatik sindirim yoluyla izole edilmesi, ardından hücre kalıntılarının ve miyelinin yoğunluk gradyanlı santrifüjleme ile uzaklaştırılması prosedürünü göstermektedir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik incelemesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Reaktiflerin Hazırlanması

1. Sindirim tamponu (yarım küre başına 1 ml): Saflaştırılmış sindirim enzimlerinin standartlaştırılmış bir karışımını, örneğin düşük termolizin konsantrasyonlu (TL) Liferaz'ı, kalsiyum (Ca) ve magnezyum (Mg) içeren Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 2U/ml konsantrasyona çözün.
2. DNAse ile yıkama tamponu: DNAse I'i, %10 fetal buzağı serumu (FCS) içeren HBSS'de (Ca/Mg (kalsiyum/magnezyum) içermez) 666U/ml konsantrasyona çözün.
3. DNAse'siz yıkama tamponu: %10 FCS içeren HBSS (Ca/Mg içermez).
4. Yoğunluk gradyan ortamı (yarım küre başına 5 ml): dokuz kısım yoğunluk gradyan ortamını bir kısım 1,5 M sodyum klorür ile karıştırarak stok izotonik yoğunluk gradyan ortamı (SIP;% 100) hazırlayın. %3 FCS içeren uygun bir hacimde HBSS (Ca/Mg içermez) ekleyerek SIP'yi %25 yoğunluğa seyreltin.

2. Serebral Dokunun Tek Hücreli Süspansiyonlara Ayrışması

1. Beyin sapını ve beyinciği temiz bir tıraş bıçağıyla dikkatlice çıkarın. Beyni yarık kesmek için temiz bir tıraş bıçağı kullanın ve koronal düzlem boyunca her yarım küreyi kabaca eşit büyüklükte üç parçaya kesin.
2. 5 ml'lik bir şırınganın piston ucunu kullanarak 100 μm'lik bir hücre süzgeci aracılığıyla her yarım kürenin disseke dokusunu kıyın. Hücre süzgecini buz gibi HBSS (+Ca/Mg) ile sürekli durulayın. Homojenize numuneleri buz üzerinde saklayın.
3. 286 x g ve 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı dikkatlice atın. Peleti 1 ml sindirim tamponu içinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 2 ml'lik bir tüpe aktarın. Süspansiyonu 1 saat boyunca 37 ° C'de yavaş sürekli dönüş altında inkübe edin.
4. Hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve 3 ml DNAse içeren yıkama tamponu ve ardından 15 ml DNAse içermeyen yıkama tamponu ile iyice durulayın. 286 x g ve 18 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. not: DNAse kullanımı, hücre lizizinin neden olduğu DNA mukusunu ortadan kaldırır, bu da hücre agregasyonuna yol açarak hücre sağkalımını tehlikeye atabilir.

3. Miyelin ve Hücre Kalıntılarının Uzaklaştırılması için Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme

1. Hücre peletini 5 ml'lik %25 yoğunluklu gradyan ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 15 ml'lik bir tüpe pipetleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek tekrarlanan ve nazik pipetleme ile iyice karıştırın. not: Hücre topaklanmasını önlemek için RT'de yoğunluk gradyan ortamı kullanılmalıdır.
2. 521 x g ve 18 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Rotorun en düşük hızlanma profilini kullanın ve rotorun fren olmadan durmasına izin verin. Tüpleri sallamadan yavaşça santrifüjden çıkarın. Tüpün altındaki hücre peletini korurken miyelin kaplamasını ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. not: Miyelin tabakasının tamamını çıkardığınızdan emin olun, çünkü kalan herhangi bir kalıntı akış sitometrik analizini bozacaktır.
3. Peletleri 10 ml DNAse içermeyen yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 15 ml'lik yeni bir tüpe pipetleyin. not: Bu yıkama adımı çok önemlidir, çünkü yoğunluk gradyan ortamının yeterli miktarda uzaklaştırılması, nihai hücre numunesinin miktarına ve kalitesine önemli ölçüde katkıda bulunur.
4. 286 x g ve 10 °C'de 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 100 μl soğuk yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve bir hemositometrede tripan mavisi dışlaması ile hücre sayımını ve canlılığını belirleyin. Numuneleri 4 °C'de saklayın ve hızlı bir şekilde işleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MACSmix Tüp Döndürücü	Miltenyi Biotec GmbH
Heraeus Multifuge 3SR+	Termo Bilimsel
Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS)	Gibco/Yaşam Teknolojileri GmbH	14175-129
Kalsiyum/Magnezyum ile HBSS	Gibco/Yaşam Teknolojileri GmbH	24020-091
Liberase TL	Roche Diagnostik GmbH	5401020001	Oda sıcaklığında kullanın
Percoll Artı	GE Sağlık Avrupa GmbH	17-5445-01
Fetal sığır serumu	PAN Biyoteknoloji	3302-P101003
Tripan mavisi	Gibco/Yaşam Teknolojileri GmbH	15250-061
Trucount Belediyesi	BD Biyolojik Bilimler	340334
Fosfat tamponlu salin	Biochrom AG	L 182-10
DNaz I	Roche Diagnostik GmbH	11284932001
Silikon Boru, 1m	Dünya hassas enstrümanlar	503022
İnce İris Makas keskin/künt	Güzel Bilim Araçları	14028-10
Düz 1x2 diş forseps	Güzel Bilim Araçları	11021-14
Künt uçlu forseps	Güzel Bilim Araçları	11008-13
5ml şırınga pistonu	Carl Roth GmbH (Braun)	EP96.1
Hücre süzgeci, 100μm	Dr. I. Schubert, BD	2360-00
Omnican İnce dozaj şırıngası 1ML	Braun	Tbd
Hücre süzgeci, 70μm	Greiner Bio-One GmbH	542 070
serolojik pipetler, 10ml	Greiner Bio-One GmbH	607180
serolojik pipetler, 10ml	Sarstedt AG & Co	86,12,54,025
serolojik pipetler, 25ml	Greiner Bio-One GmbH	760180
serolojik pipetler, 5ml	Greiner Bio-One GmbH	606180
serolojik pipetler, 25ml	Sarstedt AG & Co	86,16,85,020
serolojik pipetler, 5ml	Sarstedt AG & Co	86,12,53,025
Uçlar, 0,1-10μl	Corning B.V.Life Bilimleri	4840
Uçlar, 100-1000μl	Greiner Bio-One GmbH	740290
Uçlar, 10-200μl	Greiner Bio-One GmbH	739296
Reaksiyon tüpleri 1,5ml	Greiner Bio-One GmbH	616201
Reaksiyon tüpleri 2ml	Greiner Bio-One GmbH	623201
Bakteriyolojik petri kabı, 94x16mm	Greiner Bio-One GmbH	633180
Şahin 15ml	Greiner Bio-One GmbH	188271
Şahin 50ml	VWR Uluslararası GmbH (BD)	734-0448
Neubauer hemositometre	Biochrom AG	PDHC-N01
tıraş bıçağı	Carl Roth GmbH	CK07.1 Serisi