Parkinson Hastalığının Bir Sıçan Modelinde Levodopa ile İndüklenen Diskinezilerin İndüksiyonu

Özet

Kaynak: Caulfield, M. E., et al. Parkinson Hastalığının Sıçan Modelinde Levodopa ile İndüklenen Diskinezilerin İndüksiyonu ve Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu video, bir dopamin dönüşüm inhibitörü ile birlikte levodopa uygulayarak bir Parkinson sıçan modelinde levodopa kaynaklı diskinezileri indükleme sürecini göstermektedir. Tekrarlanan enjeksiyonlar beyin nöronlarını aşırı uyararak motor disfonksiyona neden olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Reaktiflerin ve sarf malzemelerinin hazırlanması

1. Araştırma sorusu için uygun olan L-3,4-dihidroksifenilalanin metil ester hidroklorür (levodopa veya L-DOPA) ve benserazid hidroklorür, bir periferik dekarboksilaz inhibitörü (Malzeme Tablosuna bakınız) dozunu, derecelendirme sıklığını ve deneysel zaman çizelgesini belirleyin (Şekil 1).
   not: Belirli bir tedavinin mevcut L-DOPA'nın neden olduğu diskinezileri (LID) azaltıp azaltamayacağını sormaktan LID indüksiyonunu önlemeye kadar herhangi bir sayıda cevap aramak için araştırma soruları sorulabilir. Ayrıca, terapötik etkinliğin levodopa dozuna bağlı olup olmadığını veya LID ekspresyonunun ve / veya terapötik etkinliğin deneğin cinsiyetine, türüne ve yaşına bağlı olarak değişip değişmediğini araştırabilirler.
2. Çalışma sırasında devam eden ağırlık değişikliklerine dayalı olarak uygun ilaç miktarını hesaplamak için sıçanları haftalık olarak tartın.
   not: LID + sıçanlarında artan aktivite nedeniyle, uzun süreli L-DOPA tedavileri ile kilo kaybı potansiyeli vardır. Kilo kaybı meydana gelirse, L-DOPA enjeksiyonlarını takiben sıçanlara beslenme açısından eksiksiz, oldukça lezzetli ikramlar sağlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Her haftalık konsantrasyon için gerekli olan L-DOPA ve benserazid miktarını hesaplayın, enjeksiyonun her günü için liyofilize alikotları tartın ve tedavi gününe kadar cam kehribar şişelerde -20 ° C'de 1-2 hafta boyunca kombinasyon halinde saklayın.
   not: Hedef doz 12 mg / kg veya 12 mg L-DOPA / 1000 g vücut ağırlığıdır. Ek Bilgiler, 1 cc / kg sıçan ağırlığı enjeksiyon hacminde 12 mg L-DOPA / kg vücut ağırlığı kullanılarak haftanın her günü için gereken L-DOPA ve salin miktarını belirlemek için bir hesaplama örneği sağlar.

2. Oda ve kafes kurulumu

1. L-DOPA tedavisinin ilk gününde, 6-hidroksidopamin (6-OHDA) lezyon ameliyatını takip eden 3-4 hafta, sıçanları IACUC onaylı zenginleştirme de dahil olmak üzere tek bir yuvaya aktarın.
2. Davranışsal değerlendirmelere akran müdahalesini önlemek için çalışma boyunca tek bir konutta bakım yapın.
3. LID derecelendirme günlerinde, farenin en iyi şekilde görüntülenmesi için ev kafeslerini yaklaşık 45°'lik bir açıyla döndürülmüş çelik bir tel raf üzerine yerleştirin (Şekil 2A). Davranış değerlendirmelerine müdahale etmemek için tanımlama etiketlerini (Şekil 2B) yukarı çevirin ve kafesteki su şişelerini, yiyecek raflarını ve her türlü zenginleştirmeyi çıkarın (Şekil 2C).

3. Levodopa enjeksiyonları ve diskinezi derecesi

1. Deri altı L-DOPA enjeksiyonları
   1. Günlük L-DOPA enjeksiyonundan hemen önce, kehribar şişesinde önceden tartılmış liyofilize L-DOPA ve benserazid karışımına uygun hacimde steril salin ekleyin ve 10 saniye boyunca iyice çalkalayın (adım 1.3).
      NOT: Hedef enjeksiyon hacmi 1 mL / 1000 g vücut ağırlığıdır (mL başına 12 mg L-DOPA ile). Steril salinin hacmi, çalışma başına düşen hayvan sayısına bağlı olacaktır.
   2. Tek tek şırıngaları (örneğin, 26 G iğne ile 1.0 veya 0.5 mL) her hayvan için gerekli hacimle (1 mL / kg sıçan ağırlığı) doldurun ve her şırıngayı ayrı hayvan kimliği ile etiketleyin.
      not: Doldurulmuş şırıngaları enjeksiyon zamanına kadar steril poşetlerde ışıktan koruyun. L-DOPA, sulu bir ortamda oksijen ve ışık varlığında hızla oksitlenir.
   3. İlk kafesi enjeksiyon tezgahına getirin.
   4. Fareyi kafesinden çıkarın ve enjeksiyon yüzeyine yerleştirin.
   5. Baskın olmayan elin avuç içi ile farenin üzerinde durduğu yüzeye karşı baş ve omuzları nazikçe bastırın.
   6. Baskın olmayan elin başparmağı ve işaret parmağı ile kürek kemiğinin üzerine gelecek şekilde sırttaki cildi nazikçe ovalayın. Daha sonra, kas içi enjeksiyonu önlemek için iğneyi vücuda mümkün olduğunca paralel tutarak, baskın el ile parmaklar arasındaki / altındaki deri altı boşluğa L-DOPA hacmini enjekte edin.
      not: Sıçanlar enjeksiyondan önce uyuşturulmaz.
   7. Kullanılan her bir şırıngayı keskin bir kaba atın.
   8. Fareyi kendi kafesine yerleştirin ve derecelendirmeler tamamlanana kadar davranışsal değerlendirmelere müdahale etmeyi önlemek için LID derecelendirme günleri dışında besleyici olarak eksiksiz ikramlar ekleyin.
   9. İstenen derecelendirme süresine ve derecelendirme günlerinde çalışmadaki sıçan sayısına bağlı olarak zamanlayıcıyı 1-2 dakikaya ayarlayın. Bir sonraki kafesi alın ve zamanlayıcı gösterdiğinde bir sonraki fareyi enjekte edin.
   10. Tüm fareler enjekte edilene kadar her 1-2 dakikada bir bir fareye enjekte ederek bunu tekrarlayın.
2. Enjeksiyon sonrası levodopa kaynaklı diskinezi derecesi
   1. Distonik ve hiperkinetik diskinezi hareketlerinin yoğunluğunu (Tablo 1) ve sıklığını (Tablo 2), LID davranışının ilk başlangıcını, tepe davranışını ve düşüş aşamasını içermesi gereken istenen sayıda zaman noktasında derecelendirin.
   2. Erkek ve dişi yetişkin Sprague Dawley veya Fisher 344 sıçanları ve N = 40 sıçan örneklem büyüklüğü için, ilk L-DOPA enjeksiyonundan 20 dakika sonra diskinezi derecelerine başlayın ve daha sonra enjeksiyondan 220 veya 270 dakika sonrasına kadar 50 dakikalık aralıklarla, sıçanların %90-100'ünde LID davranışlarının ne zaman kesildiğine bağlı olarak.
   3. 1 dakikalık derecelendirme aralıkları kullanıyorsanız, 1 dakikalık bir zamanlayıcı ayarlayın. İlk fareyi bir dakika boyunca değerlendirin. Bir sonraki fareye geçin ve 1 dakika boyunca derecelendirin. Tüm sıçanların üzerinden devam edin, 1 dakikalık aralıklarla derecelendirin.
   4. Derecelendirme süresi boyunca herhangi bir davranışın (Tablo 1) sıklığını tahmin ederken LID davranış yoğunluğunun (Tablo 2) gözlemlenebilmesi için kafesin yanına görünür bir şekilde yerleştirilmiş bir zamanlayıcı bulundurun.
   5. İlk zaman noktası için derecelendirmeler tamamlandıktan sonra, bir sonraki zaman noktasında (örneğin; enjeksiyondan 70 dakika sonra) ilk sıçan ile tekrar başlayın ve tüm zaman noktaları tamamlanana kadar istenen aralıkta (örneğin her 50 dakikada bir) devam edin.
      not: L-DOPA enjeksiyonu ve LID derecelendirme görevlerinin örtüşmesi nedeniyle, derecelendirme günlerinde biri enjeksiyon ve diğeri davranışsal derecelendirme için olmak üzere iki kişiye ihtiyaç vardır.

Sonuçlar

Şekil 1: Tedavi zaman çizelgesi örneği. Örnek L-DOPA doz artış zaman çizelgesi toplam uzunlukta 12 hafta, 8 haftalık L-DOPA enjeksiyonları 6-OHDA lezyonundan 3 hafta sonra ve deneysel tedaviden 4 hafta sonra başlar. Bu örnekte, L-DOPA, reçete edilen her L-DOPA dozunda (3, 6, 9 ve 12 mg / kg) 2 hafta boyunca, her gün yaklaşık aynı saatte haftada 5 kez (Pazartesi-Cuma) deri altına enjekte edilir. Davran...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 Dakika Dijital Zamanlayıcı	Zımba	1111764
Compass CX Kompakt Tartı	Ohaus Belediyesi	30428202
5-(2-aminoetil)-1,2,4-benzentriol, monohidrobromür	Cayman Kimyasalları	25330	6-OHDA, kemirgenlerde dopaminerjik lezyonları ve parkinson semptomlarını indüklemek için kullanılan katekolaminerjik bir nörotoksindir.
Allentown kafesleri	Allentown, LLC	Sıçan900	Allentown kafesleri, fareleri her yönden görme yeteneği sağlar.
Kalıcı Olarak Takılan İğneli BD Alerjist Tepsileri	Bd	BD 305540	Deri altı L-DOPA enjeksiyonları için
Benserazid hidroklorür	Sigma-Aldrich	B7283	Benserazid, PD'nin kemirgen modellerinde diskinezi indüklemek için L-DOPA ile birlikte kullanılan periferik bir dekarboksilaz inhibitörüdür.
Cam kehribar parıldama şişeleri	Termo Bilimsel	B7921	L-DOPA/benserazidin steril tuzlu su ile karıştırılana kadar -20 °C'de saklanması için kullanılır.
L-3,4-Dihidroksifenilalanin metil ester hidroklorür	Sigma-Aldrich	D1507	L-3,4-Dihidroksifenilalanin metil ester, kan-beyin bariyerini geçen ve kemirgenlerde parkinson semptomlarını tedavi etmek için kullanılan L-DOPA'nın bir öncüsüdür.
Paper Mate Sharpwriter Mekanik Kalemler	Zımba	107250
Kemirgen besinsel olarak tam zenginleştirme davranır	Biyo-Serv	F05478
Kapaklı Yuvarlak Buz Kovası, 2,5 L	Corning	432129
Standart Plastik Pano	Zımba	1227770
Çelik telli 6' uzunluğunda hareketli raf üniteleri	Uline Hattı	H9488	Genişlik / Yükseklik, deney başına ihtiyaca / sıçan sayısına göre ayarlanabilir
Steril Tuzlu Sali% 0.9	Covidien/Argyle	1020	L-DOPA/bens ile karıştırmak için

Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Yılı