Kortikal Organoid Kesitte Nöronal Yaşlanmanın Saptanması

Özet

Kaynak: Shaker, M. R., et al. In Vitro Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Tekrarlanabilir Üretimi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, yaşlanan hücrelerde yüksek olan beta-galaktosidaz aktivitesini boyayarak kortikal organoid bölümlerde yaşlanan nöronları tespit etme yöntemini göstermektedir. Enzim, mavi bir ürün üretmek için bir substratı parçalar, ardından lekeli nöronların mikroskobik gözlemi yapılır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Kortikal organoidlerde nöronal yaşlanmanın karakterizasyonu

1. Kriyoseksiyonlar için kortikal organoidleri işleyin:
   NOT: Adımlar, Sınıf 2 biyogüvenlik başlığında gerçekleştirilmiştir.
   1. Her biri 1,5 mL %4 paraformaldehit (PFA) ile doldurulmuş 2 mL tüp hazırlayın.
   2. Bir P1000 pipet ucunun ucunu kesin (geniş delikli hale getirmek için) ve her bir organoidi yukarıda hazırlanan 2 mL'lik tüplerden birine (tüp başına bir organoid) nazikçe aktarın.
      NOT: Fazla Farklılaşma Ortamı (DM) ortamının PFA ile karışmasını önlemek için, organoidin P1000 pipet ucunun açıklığına doğru batmasına izin verin ve organoidi pipetlemeden önce ucu tüpteki PFA'nın üst kısmının hemen üzerinde tutun. Bu, araştırmacının sadece organoid ve çok minimal ortamı aktarmasını sağlayacaktır.
   3. Fiksasyon işleminin 1 saat boyunca 4°C'de gerçekleşmesine izin verin.
   4. Kesilmemiş bir P1000 pipet ucu kullanarak, fazla PFA'yı dikkatlice aspire edin ve 1,5 mL soğuk 1x PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su) ekleyin.
   5. Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 70 rpm'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıya aktarın.
   6. Tüm PFA'nın tamamen çıkarıldığından emin olmak için yıkama işlemini soğuk 1x PBS ile üç kez tekrarlayın.
      NOT: PFA'yı normal atık kaplarına atmayın; bunun yerine, PFA bir tehlike olduğundan, bunun için özel bir kimyasal atık bertaraf kabı hazırlayın.
   7. Organoidleri% 30 sükroz içeren 1x PBS'ye daldırın ve tüm organoidler tüpün dibine batana kadar 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Organoidlerin batması için gereken süre, boyutlarına ve yaşlarına bağlıdır. Üç aylık organoidler 5 saate kadar sürebilir.
   8. Kesilmiş, geniş delikli bir P1000 pipet ucu kullanarak, üç ila beş organoidi, 3:2 oranında %30 sükroz ve %100 optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamından yapılmış bir montaj solüsyonu içeren bir montaj kalıbına nazikçe aktarın.
   9. Organoidleri ızgara benzeri bir düzende yönlendirmek ve konumlandırmak için stereomikroskop yardımıyla 10 μL'lik bir pipet ucu kullanın.
   10. Bir kriyostat kullanarak kriyo-kesit (16-20 μm) ile devam etmeden önce sükroz OCT çözeltisini katılaştırmak için kalıbı kuru buz üzerine yerleştirin.
       NOT: Yaşlanma ile ilişkili beta-galaktosidaz için, tüm dokular battıktan sonra kesit için işlenmelidir. İmmünofloresan için, dokular ertesi gün kesit almak üzere işlenebilir. Hemen boyanmazsa, bölümleri içeren tüm slaytlar, sonraki immünofloresan veya beta-galaktosidazdan önce -20 °C'de saklanmalıdır.
2. Kortikal beyin organoidlerinde yaşlanma analizi süreci:
   NOT: Aşağıdaki adımlar normal bir laboratuvar tezgahında gerçekleştirilebilir.
   1. Slaytları kapaklı bir mikroskop lam boyama kabına aktarın ve fazla montaj solüsyonunu çıkarmak için kesitli organoid dokuyu RT'de 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez yıkayın.
   2. Bunu takiben, yıkanmış dokuyu yeni yapılmış beta-galaktosidaz boyama solüsyonu ile gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Beta-galaktosidaz boyama çözeltisi fosfat tamponundan yapılmıştır (10 mL fosfat tamponu için: 8.15 mL 1 M NaH₂PO₄, 1.85 mL 1M Na₂HPO₄) ayarlanmış pH = 6, 100 mM potasyum hekzasiyanoferrat (III), 100 mM potasyum hekzasiyanoferrat (II) trihidrat, 5 M NaCl, 1 M MgCl₂, 20 mg/mL X-Gal. CO₂ beta-galaktosidaz boyama çözeltisinin pH'ını değiştireceğinden, CO₂ içeren standart bir hücre kültürü inkübatörü kullanmaktan kaçının.
   3. Beta-galaktosidaz çözeltisini çıkarmak için, lekeli dokuları RT'de her biri 10 dakika boyunca üç kez 1x PBS ile yıkayın.
   4. Yıkanmış dokuları bir cam antifade tutucu ile monte edin ve mikroskop altında görüntülemeden önce montaj solüsyonunun RT'de 30 dakika katılaşmasına izin verin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%16 Formaldehit (W/V) Metanol içermez	Thermo Fisher Bilimsel	28908	PFA'nın %4'ü 1x PBS'de seyreltilir
SC50 kameralı CKX53 mikroskobu	Olympus
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Sigma Aldrich Ticaret A.Ş.	D1408-500ML
Nörobazal Orta	Thermo Fisher Bilimsel	21103049	DM ortamında kullanılır
OCT Gömme Bileşiği Sakura Clear (118 mL/Şişe)	Doku Tek	4583
Potasyum Hekzasiyanoferrat (II) Trihidrat	Sigma Aldrich Ticaret A.Ş.	CP1087
Potasyum hekzasiyanoferrat(III)	Sigma Aldrich Ticaret A.Ş.	455946
Prolong Cam Antifade Mountant	Yaşam Teknolojileri Avustralya (TFS)	P36980 Serisi
Sakaroz	Sigma Aldrich Ticaret A.Ş.	PHR1001-1G	Sükrozun %30'u 1x PBS'de seyreltilir

Serisi Serisi