Bir Fare Modelinde Kullanıma Bağlı Nöbetler

Özet

Kaynak: Batot, G., et al. Theiler'in Murin Ensefalomiyelit Virüsü kullanılarak Enfeksiyöz Etiyolojinin Epilepsisi için Bir Model. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, Theiler'in Murin Ensefalomiyelit Virüsü (TMEV) ile enfekte olmuş bir farede elleçlemeye bağlı nöbetlerin indüksiyonunu göstermektedir. Hiperuyarılabilir nöronlara sahip olan enfekte fare, dış fiziksel uyaranlara maruz kalır. Bu maruziyet strese neden olarak nöronlarda anormal elektriksel aktiviteye yol açar ve bu da nöbetlerle sonuçlanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Virüs aşısı

1. Enjeksiyon şırıngasının sterilizasyonu
   1. İnsülin şırıngasının kapağını çıkarın. 2,5 mm'lik yeterli enjeksiyon derinliğini sağlamak için iğnenin etrafına bir yaka olarak polietilen boru ekleyin. Şırıngayı 30 dakika etanole batırın. Şırıngayı 30 dakika UV ışığı altında tutun.
   2. Kapağı tekrar iğnenin üzerine koyun. Şırıngayı sterilizasyon poşetine sarın ve bantla kapatın. Hazırlanma tarihi ile etiketleyin.
2. Virüs enjeksiyonu
   1. -80 °C'lik dondurucudan Daniel'in TMEV türünden alikotlar alın. Virüsü çözün ve buz üzerinde tutun. Virüsü çözmekten ve yeniden dondurmaktan kaçının. Şırıngayı virüs süspansiyonu ile yükleyin (3 x 10⁵ plak oluşturan birim [PFU], 20 μL fosfat tamponlu salin [PBS] veya Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı [DMEM] kültür ortamı içinde seyreltilmiş).
      DİKKAT: Virüs fareler için bulaşıcıdır ancak insanlar için bulaşıcı değildir.
   2. Tezgahı bir dezenfektanla temizleyin ve bir duman emici altında çalışın. Virüs aşılaması steril değildir, ancak mümkün olduğunca temizdir.
   3. Fareyi anestezi indüksiyon odasına aktarın ve anesteziyi indüklemek için oksijende% 2 izofluran kullanın. Cerrahi toleransa ulaşmak birkaç dakika sürer; Konsantrasyonu hayvanın solunumuna ve anestezi derinliğine göre ayarlayın.
   4. Anestezi uygulanmış fareyi kaputun altındaki anestezi kutusundan aktarın. Cerrahi toleransı kontrol edin, örneğin ayak parmağınızı sıkıştırarak. Tüm prosedür 30 saniyeden daha kısa sürede gerçekleştirilir, bu nedenle hayvanın enjeksiyon sırasında izofluran solumasına gerek yoktur. Korneanın kurumasını önlemek için göz merhemi ekleyin.
   5. Hayvanın kafasını alkollü bir ped ile temizleyin. Farenin başını, enjeksiyon bölgesi yukarı bakacak şekilde hafifçe sola eğin.
   6. Cildi biraz geriye doğru çekin, iğneyi kafaya sokun ve sağ hemisferin temporal bölgesinde (sağ gözün arka ve medial) 2,5 mm derinliğe intrakortikal olarak 20 μL enjekte edin.
   7. Enjeksiyonu tüm hayvanlarda aynı yarım kürede tek taraflı olarak gerçekleştirin. Parietal korteksin yeri için göz ve kulağı yer işareti olarak kullanın. Yerleştirme daha önce histolojik olarak doğrulanmıştır; bkz. Şekil 1. Bregma ile ilgili olarak stereotaksik enjeksiyona göre enjeksiyon koordinatları -2.0 (AP); +3.0 (ML); -1.5 (DV).
   8. Şırıngayı 5-15 saniye yerinde bırakın. Enjeksiyondan herhangi bir sızıntı olup olmadığını veya hava kabarcıkları görülüp görülmediğini not edin - bu durumda yeni bir şırınga hazırlayın. Şırıngayı dikkatlice dışarı çekerken, hafifçe döndürün. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için göz merhemi sürün.
   9. İSTEĞE BAĞLI: Yerel prosedürlere bağlı olarak hayvanı kuyruğuna veya kulağına kodlayın (isteğe bağlı ancak hayvan bilinçsiz olduğu için kolay).
   10. Hayvanı, anesteziden sonra iyileşme sırasında bir ısıtma yastığının (35-40 ° C) yarısı / yarısı kapalı olarak yerleştirilen yeni bir kafese aktarın. Sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanları gözetimsiz bırakmayın.
       NOT: Hayvanlar iyileştikten sonra tekrar grup halinde barındırılabilir (enfekte hayvanlar, sahte enfekte hayvanlarla karıştırılmaz). Enfekte fareler, enfekte olmayan farelerle aynı odada barındırılmamalıdır.
   11. Enfeksiyondan sonraki ilk 7 gün boyunca farelerin ağırlığını takip edin, çünkü enfeksiyondan sonra kilo verirler ve ek beslenmeye ihtiyaç duyabilirler.

2. Elleçleme kaynaklı nöbetlerin nöbet izlemesi

1. Bu prosedürü, tedaviye kör olan bir deneyci tarafından gerçekleştirin. Tüm kafesleri bankın üzerine getirin. Işık fazı sırasında hayvanları günde 2 kez nöbet açısından gözlemleyin.
2. Nöbet aktivitesini modifiye edilmiş bir Racine ölçeği ile puanlayın: 0 = davranışta değişiklik yok, 1 = ağız ve yüz hareketleri, 2 = baş sallama, 3 = tek taraflı ön ekstremite klonusu, 4 = iki taraflı ön ekstremite klonusu ile birlikte, 5 = postüral ton kaybı ile genelleştirilmiş tonik-klonik aktivite, bazen sıçrama, 6 = uzun süreli ve aşırı sıçrama ve hiperaktivite. Nöbetlerin sayısını ve yoğunluğunu bildirin.
3. Biraz ses çıkarmak için kafesin üzerinde bir kalem kaydırın.
4. Her hayvanı başka bir kutuya aktarın ve geri alın.
5. Hayvanların kafesin yanlarına veya tepesine çarpacağı ve fiziksel yaralanma tehlikesiyle karşı karşıya kalacağı kadar kuvvetli bir şekilde kafesi sallamamaya dikkat ederek, ileri geri hareketlerle kafesi nazikçe sallayın.
6. Kafesteki tüm hayvanları nöbetler açısından izleyin. Herhangi bir zamanda, bir farenin nöbet geçirmesi durumunda, onu ev kafesine geri aktarın ve gürültü veya işleme ile daha fazla nöbet uyarımı olmadan nöbet seviyesini yazın.
7. Kendiliğinden veya hafif kafes sallamasından sonra nöbet geçirmemiş hayvanlar için, daha yoğun bir şekilde ele geçirilerek nöbetleri tetikleyin: Fareyi kuyruğundan soldan sağa çevirerek dikkatlice ters çevirin.
   NOT: Nöbet geçiren hayvanlar aşırı uyarılabilir ve ürkek olabilirler.
8. Her hayvanı tekrar nöbet davranışı açısından gözlemleyin. Sonraki kafesler için işlemi tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: TMEV enjeksiyon işleminin şeması. Soldan sağa: Sağ parietal korteks enjeksiyonu için iğne, göz ile karşı kulak arasındaki hayali bir çizginin biraz yanına enjekte edilir. Derinlik kontrolü için yaka sarı ile belirtilmiştir. Enjeksiyon yolu, okla işaretlenmiş koronal beyin bölümünde görülebilir. Enjeksiyon bölgesi, okun üzerinde verilen koordinatlara karşılık gelir. Sağdaki görüntü, Theiler v...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hayvan dengesi	Ohaus (Parsippany, NJ, ABD)	STX2202	0,01 g–2200 g
BD Lo-Dose U-100 İnsülin Şırıngaları	BD (Mississauga, ON, Kanada)	BD329461	Kalıcı BD Micro-Fine IV iğneli Lo-Dose steril şırıngalar - 1 mL
Daniel'in TMEV türü	Robert Fujinami (Utah Üniversitesi)	-	3 x 105 plak oluşturan birim aliquot(s)
Dezenfektan, örneğin VennoVet 1 super	Menno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Almanya	-	%5'e eşit veya daha az alkol içeren kampüs veterinerleri tarafından önerilir
Fisherbrand orta steril Alkol hazırlama pedi C7	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ABD)	22-363-750
Fluriso	VETone (Boise, ID, ABD)	502017	İzofluran 250 mL, %2–%5
Duman emici	Labconco (Kansas City, MO, ABD)	-	-
Genel Koruma Tek Kullanımlık SMS Beyaz Laboratuvar Önlükleri	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ABD)	17-100-810A
Buz kovası	-	-	herhangi
Fare kafesi	-	-	en az 5 fare tutan herhangi bir fare kafesi
PrecisionGlide iğneleri	BD (Mississauga, ON, Kanada)	329652	PrecisionGlide İğneli BD Kayma Ucu İnsülin Şırıngaları - 26 G x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Kendinden Sızdırmaz Sterilizasyon Torbası	Fisher Scientific (Hampton, NY, ABD)	NC9241087	12,6 x 25,5 cm
Küçük cam şişe	-	-	herhangi, hacim 25 mL
steril PBS	Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ABD)	10010056
Şırınga Luer-Lok	BD (Mississauga, ON, Kanada)	309628	Yalnızca 1 mL şırınga
Ultrasonik Temizleyici, Isıtıcı/Mekanik Zamanlayıcı	Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, ABD)	EW-08895-23	Banyo sonikatörü - 0,5 gal, 115 V

tarafından sağlanmıştır