$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Lizofosfatidilkolin (LPC) çözeltisi hazırlama
- % 10'luk bir LPC çözeltisi yapmak için 25 mg LPC tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) 250 μL kloroform ve metanol karışık çözelti (1: 1) ile çözün ve 500 μL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
NOT: LPC tamamen çözülmezse, santrifüj tüpünü ultrasonik bir temizleyiciye yerleştirin ve homojen bir çözelti elde etmek için ~ 1 saat boyunca 40 kHz'de ultrasonikat edin.
- Çözeltiyi 3 μL/tüpe bölün ve −80 °C.
'de saklayın
NOT: Çözelti ~ 2 yıl boyunca saklanabilir.
- Ameliyattan önce, çözeltiyi (adım 1.2) 27 μL% 0.9 Sodyum klorür (NaCl) çözeltisi ile seyreltin ve çözeltiyi 37 ° C'de sabit sıcaklıktaki bir su banyosunda tutun.
NOT: Enjeksiyona başlamadan hemen önce çözeltiyi hazırlayın.
2. Cerrahi hazırlık
- 5 μL'lik bir şırıngaya bağlamak için 32 G, 2 inçlik bir iğne kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Mikrolitre şırınganın engellenmediğinden emin olun. Enjeksiyonu hazırlamak için 5 μL LPC solüsyonu çekin.
- Fareyi, yaklaşık 0,3 L/dk oranında %100 oksijen ile karıştırılmış %3 izofluran içeren bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir indüksiyon odasında uyuşturun.
- Solunum pürüzsüzken ayak parmağını kıstırma refleksinin olmamasıyla anestezi derinliğini onaylayın.
- Elektrikli tıraş makinesi kullanarak farenin başını kulakların arasında tıraş edin. İşlem sırasında kornea kuruluğunu önlemek için kayganlaştırıcı göz damlaları uygulayın.
- Ardından, fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik bir çerçeveye (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin ve kafayı bir burun konisi ve diş kelepçesi ile sabitleyin. Burnundan %1.2-%1.6 izofluran ile anesteziyi sürdürün.
not: İzofluran konsantrasyonu, farelerin solunum durumuna göre ayarlanabilir.
3. Cerrahi prosedür
NOT: Hayvanlar tüm işlemler sırasında bir ısıtma yastığına yerleştirilir.
- Fareyi iki taraflı kulak çubukları ile stereotaksik cihaza sabitleyin. Kulak çubuklarının düz olduğundan ve başın yatay ve sabit olduğundan emin olun.
- Kafadaki cildi iyodofor ile birkaç kez silerek dezenfekte edin, ardından dairesel hareketlerle alkol alın. Daha sonra, kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisinin orta hattı boyunca yaklaşık 1,5 cm'lik küçük bir kesi kesmek için bir neşter kullanılır.
- Kafatasını, bregma, lambda ve arka bıngıldak açığa çıkana kadar% 1 hidrojen peroksit içine batırılmış bir pamuklu çubukla silin. Şırıngayı stereotaksik aparatın üzerine yerleştirin.
NOT: Hidrojen peroksiti dikkatli kullanın ve çevredeki dokulara dokunmaktan kaçının.
- Hayvanın başının yatay olarak konumlandırıldığından emin olun (hem ön hem de arka ve sol ve sağ).
- Stereotaksik çerçevenin Z ekseni düğmesini, iğne ucu ve kafatası bükülmeden birbirine değecek şekilde ayarlayın, ardından Z ekseni koordinatını ölçün. Bregma ve posterior bıngıldağın Z koordinatlarını kontrol edin.
- Kulak çubuğunu, bregma ve posterior fontanelin Z koordinatları arasındaki fark 0,02 mm'den fazla olmayacak şekilde ayarlayın. Ardından, orta hattın sol ve sağ taraflarındaki karşılık gelen konumların Z koordinatlarını ölçmek için aynı yöntemi izleyin. Sol ve sağın aynı seviyede olduğundan emin olmak için kulak çubuğunu ayarlayın.
- Korpus kallozum'u bulun. XYZ kaynağını bregma.
olarak ayarlayın
NOT: İlk enjeksiyon bölgesi bregmanın 1.0 mm lateralinde, 2.4 mm derinliğinde ve 1.1 mm öndedir. İkinci enjeksiyon bölgesi bregmanın 1.0 mm lateral, 2.1 mm derinliğinde ve 0.6 mm anteriordur. Örneğin, bregmanın koordinatı (0,0,0)'dır. (-1, 1.1, X) ve (-1, 0.6, Y) olarak işaretlenmiş ilgili konumun Z koordinatını ölçün. Korpus kallozumun ilk enjeksiyon bölgesi koordinatı (-1, 1.1, -[X + 2.4]) ve ikinci enjeksiyon bölgesi koordinatı (-1, 0.6, -[Y + 2.1]) olarak belirlenebilir.
- Enjeksiyon bölgesi belirlendikten sonra, kafatası üzerinde steril bir işaretleyici ile bir işaret yapın ve koordinatları kaydedin.
- İşaretli bölgeyi bir kafatası matkabı ile nazikçe delin (bkz. Malzeme Tablosu). Herhangi bir kanama olmamasına dikkat edin.
- İğneyi yavaşça verilen koordinatlara hareket ettirin ve enjeksiyonu başlatın. Korpus kallozum demiyelinasyonu indüklemek için, her enjeksiyon bölgesine (adım 3.5.) 0.4 μL / dak oranında 2 μL LPC çözeltisi (adım 1.2) enjekte edin.
- Enjeksiyondan sonra, iğneyi her bölgede 10 dakika daha
tutun
NOT: İki enjeksiyon aralığının 20 dakikadan fazla olmadığından emin olun.
- Cildi 4-0 dikişle dikin ve hayvanın 10 dakika içinde uyanmasını bekleyin. Ameliyat sonrası kurumsal hayvan bakımı yönetmeliklerine uygun olarak analjezikler uygulayın.
NOT: Ötanazi için önerilen süre deneyin amacına göre belirlenebilir.