$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Hemoglobin ve BOS çözeltilerinin hazırlanması
- 1.5 mL'lik bir mikrotüpe 500 μL aCSF çözeltisi ekleyerek steril bir yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
- 1.5 mL'lik bir mikrotüpte 500 μL aCSF'ye 75 mg hemoglobin ekleyerek steril bir 150 mg / mL hemoglobin çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
2. Hayvanın enjeksiyon için hazırlanması
- Farenin vücut ısısını korumak için ısıtma yastığını orta ayara getirin.
- Doğum sonrası 4. gün (P4) sıçanları% 3 izofluran ile doldurulmuş bir indüksiyon odasında anestezik.
not: Her 15 dakikada bir ayak parmağı / kuyruk kıstırma tepkisini kullanarak yeterli anesteziyi onaylayın. Doku renginin, vücut sıcaklığının ve solunum hızının görsel gözlemi ile anesteziyi izleyin.
- Anestezi uygulanmış sıçana 5 mg / kg deri altı carprofen enjeksiyonu ile ağrı kesici uygulayın.
- Anestezi uygulanmış sıçatanı, burun anestezi adaptörüne sabit bir %1.5 izofluran akışıyla yerleştirilecek şekilde stereotaktik aparata yüzüstü yerleştirin.
- Başı sabitlemek için dış kulak teritüsündeki yırtılmamış kulak bantlarını sıkın.
not: Enjeksiyon yaşında gözler açıksa gözleri nemli tutmak için veteriner merhemi sürün.
- Betadin ve% 70 etanole batırılmış steril pamuk uçlu aplikatörlerle dönüşümlü olarak kafayı temizleyin.
- Betadin ile ıslatılmış aplikatöre kafa derisinin ortasına dokunun ve betadini dışa doğru hareket ettirerek daireler halinde yayın.
- Etanole batırılmış aplikatör ile 2.6.1.1 adımını tekrarlayın.
- Adım 2.6.1.1 ve adım 2.6.1.2'yi 3 kez tekrarlayın.
- Cerrahi alanı korumak için steril bir cerrahi örtü uygulayın.
- Steril bir neşter kullanarak, kafatasının bregmasını ortaya çıkarmak için başın ortasından dikey olarak 0,3 cm'lik bir kesi yapın.
not: Lambdadan enjekte ediliyorsa, bregma yerine kafatasının lambdasını ortaya çıkarın.
- Alanı kurutmak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
3. Stereotaktik enjektörün kurulması
- Adım 1.2'de hazırlanan hemoglobin solüsyonunu 30G iğne ile 0.3 mL'lik steril bir şırıngaya çekin ve şırıngayı stereotaktik enjektör sistemine yerleştirin.
not: Kontrol koşulları oluşturuyorsanız, adım 1.1'de hazırlanan aCSF solüsyonunu 0.3 mL'lik steril bir şırıngaya çekin ve protokole devam edin.
- Stereotaktik enjektör arayüzünü açın ve enjeksiyon hacmi ve hızı ayarlarını girmek için Yapılandırma düğmesine tıklayın.
- Ses'e tıklayın ve ses seviyesini 20.000 nL (20 μL) olarak ayarlayın.
- İnfüzyon hızına tıklayın ve hızı 8.000 nL/dk (8 μL/dk) olarak ayarlayın.
- Pos'u Sıfırla düğmesine tıklayarak Yapılandırmadan çıkın.
- İğne ucunda küçük bir hemoglobin çözeltisi boncuk çıkana kadar İnfüzyon düğmesine tıklayarak iğne ucunu yıkayın.
- Hemoglobin solüsyonunu steril pamuk uçlu bir aplikatör ile iğne ucundan nazikçe fitilleyin.
4. Hayvan enjeksiyonu
- Yıkanmış şırınga iğnesinin ucunu bregmadaki kafatasına hafifçe dokunmak için indirmeden önce şırınganın mediolateral ve anteroposterior pozisyonlarını ayarlayarak bregmayı stereotaktik enjektör sisteminde sıfır olarak ayarlayın.
not: Lambdadan enjekte ediliyorsa, lambdayı sıfır olarak ayarlayın.
- Tercih edilen koordinatları belirleyin.
- Bregmadan enjekte ediliyorsa, burada tarif edilen P4 sıçanlarında, bregmadan 1.5 mm lateral, 0.4 mm ön ve 2.0 mm derinlik kullanın.
- Lambdadan enjekte ediliyorsa, P4 sıçanları için aşağıdaki koordinatları kullanın: lambdadan 1,1 mm yanal, 4,6 mm ön ve 3,3 mm derinlik.
- Saç derisini temizlemek için şırınga iğnesini kafatasının 1 cm yukarısına kaldırın. Şırınga kaldırıldığında, mediolateral ve anteroposterior koordinatları ayarlamaya devam edin.
- Kafatasına hafifçe dokunmak için şırınga iğnesini indirin. İğnenin kafatasına temas edip etmediğini kontrol edin.
- Dorsoventral koordinatı 30 sn'lik bir süre boyunca ayarlayın.
not: Dorsoventral koordinatı ayarlarken, iğne kafatasını delecektir. Şırınganın kafatasını deforme etmeden kafatasından geçmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Deformasyon meydana gelirse, iğneyi dorsoventral koordinat boyunca yavaşça çekerek ve ardından iğneyi aynı yörünge boyunca geri yerleştirerek kafatası deformasyonu önlenir. Bu, iğnenin kafatasındaki delikten daha az kuvvetle ve deformasyon olmadan geçmesini sağlar.
- Stereotaktik enjektör arayüzünde, enjeksiyona başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
- Enjeksiyon bittikten sonra, çözeltinin geri akışını en aza indirmek için şırınga iğnesini 2 dakika yerinde bırakın.
- Şırıngayı, iğne ucu kafa derisinin 2 cm üzerine gelene kadar dorsoventral koordinat boyunca 2 dakika boyunca yavaşça çekin.
- Stereotaktik enjektör kolunu çalışma alanından uzağa döndürün.
5. Ameliyat sonrası bakım
- Kafa derisini 6-0 monofilament sütür ile kapatın. 0,3 cm'lik insizyonun ortasına basit bir kesintili dikiş atın.
- Yavruyu anesteziden çıkarın ve ısıtma yastığı üzerinde güvenli bir alana yerleştirin.
- Barajının bakımı altında anesteziden kurtulmak için kemirgeni ev kafesine geri koyun.
not: Barajın bakımına zamanında dönüş, ameliyat sonrası erken mortaliteyi azaltır.
- Ameliyattan sonra 3 saat boyunca saat başı doğru refleks kaybı ile hayvanları anestezi için izleyin.
- Hayvanları normal aktivite, gıda alımı ve kilo alımı için 7 gün boyunca günlük olarak izleyin. Ameliyat bölgesinde yara iyileşmesi, kapanması ve kürkün yeniden ortaya çıkması için insizyon bölgesini izleyin.
not: İzleme sırasında nöbetler, merkezi depresyon veya iştah azalması gibi nörolojik değişikliklerin gözlendiği nadir durumlarda, anestezi altında intravasküler perfüzyon veya servikal çıkık kullanarak hayvana ötenazi yapın.
- Sütür kapatıldıktan ve yara iyileştikten sonra enfeksiyonu önlemek için, insizyon bölgesinde topikal üçlü antibiyotik uygulayın.