Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Isı kaynaklı nöbet testi için hazırlık
- Isı odasındaki Güç Açma düğmesini ve ardından Isı Açma düğmesini açın.
- Dijital sıcaklık kontrol cihazındaki tuş takımını kullanarak ısı odasının sıcaklığını 50 °C'ye ayarlayın.
- İlk fareyi hazneye sokmadan önce hazneyi 1 °C'ye ısıtmak için en az 50 saat bekleyin. Ön ısıtma, hazne içinde eşit ısıtma sağlar.
- Fare ısı odasının zeminini koçanı yatakları ile hizalayın.
- Her ısıya bağlı nöbet tahlil denemesini kaydetmek için ısı odasının önüne bir video kayıt kamerası monte edin.
- 140 mm çapında bir Petri kabını kalın kağıt mendil tabakalarıyla kaplayın ve soğutma pedi görevi görmesi için buzun üzerine yerleştirin.
not: Testin sonunda, bireysel fareler, yüksek vücut sıcaklıklarını düşürmeye yardımcı olmak için önceden soğutulmuş soğutma pedine aktarılacaktır.
2. Fareyi ısıya bağlı nöbet testi için hazırlama
- Sıcağa bağlı nöbet tarama testi için 10 yetişkin fare (P30-P40), epilepsiye neden olan mutasyonu taşıyan 5 ve vahşi tip çöp arkadaşlarından 5'i seçin.
not: Epilepsiye neden olan herhangi bir mutasyonu barındırmayan vahşi tip fareler, 44 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda ısıya bağlı nöbetler geçirmezler ve kontrol grubu olarak görev yaparlar.
- Tarama testi için kullanılacak her fareyi tartın ve vücut ağırlığını kaydedin. Test için sadece 15 g veya daha fazla ağırlığa sahip fareler kullanılmalıdır.
- Fare ısı odasında her seferinde bir fareyi tarayın.
- Bir çan kavanozunun dibinde birkaç damla izofluran kullanarak fareyi 10-15 saniye boyunca kısaca uyuşturun.
- Hayvanı çan kavanozundan çıkarın ve bir kağıt havlu üzerine koyun.
- Farenin zararlı bir ayak parmağı sıkışmasına tepki vermediğini kontrol ederek farenin tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
- Rektal sıcaklık probunun metal ucunu bir kayganlaştırıcı (vazelin gibi) ile kaplayın ve 2 cm'ye eşit veya daha az bir derinlikte fareye nazikçe yerleştirin.
- Rektal probu farenin kuyruğuna bantla sabitleyin, böylece prob test sırasında dışarı çıkmaz.
not: Alternatif olarak, hayvanı bir fare tutucu konisine yerleştirin ve rektal sıcaklık probunu yerleştirin. Kuyruğa bantlayarak sabitleyin.
- Rektal probun, farenin iç vücut sıcaklığını gösteren bir multimetreye bağlı olduğundan emin olun.
- Hayvanı koçan yatağı ile kaplı yeni bir kafese, yani kurtarma kafesine yerleştirin.
- Bir zamanlayıcı başlatın ve 5 dakika bekleyin. Fareyi anesteziden tamamen iyileşene ve fare aktif ve tımar olana kadar gözlemleyin.
- Aynı zamanda, farenin çekirdek vücut sıcaklığını 35-36 °C'de stabilize olana kadar izleyin.
- 5 dakikanın sonunda farenin vücut ısısına dikkat edin. Bu, "0" min.
zamanındaki ilk vücut sıcaklığıdır.
not: Farenin çekirdek vücut sıcaklığı 35 °C'nin altındaysa, hayvanın anesteziye bağlı hipotermiden kurtulması için ek süre bekleyin.
- Tek tek fareyi hızlı bir şekilde önceden ısıtılmış fare bölmesine aktarın. Bu, deney denemesinin BAŞLANGICI'nı işaret eder. Belirli bir zamanda yalnızca bir fare taranır.
3. Isı kaynaklı nöbet testi
- Fareyi önceden ısıtılmış fare ısı odasının zeminine nazikçe yerleştirdikten sonra, pleksiglas kapıyı kapatın ve deneyi video kaydı için kamerayı başlatın.
- Kronometreyi başlatın. Deney süresince 1 dakikalık aralıklarla rektal termometreden farenin vücut sıcaklığını kaydedin.
- Düzenli aralıklarla, fare ısı odasının sıcaklığını, farenin vücut sıcaklığı 0,25-0,5 °C /dak.
oranında artacak şekilde artırın.
not: Vücut ısısındaki hızlı artışlar sıcak çarpmasına veya ölüme neden olabilir ve bundan kaçınılmalıdır.
- Bu protokolü takiben, fare ısı odasının sıcaklığını Şekil 5A'da gösterildiği gibi her 10 dakikada bir 1 °C artırın.
- 9.5 dakikada, dijital sıcaklık göstergesinde gösterildiği gibi 55. dakikaya kadar ısı odasının sıcaklığını 55 °C'ye sabitlemek için ısı odasının sıcaklığını 10 °C'ye ayarlayın.
- Benzer şekilde, ısı odasının sıcaklığını 20. dakikada 60 °C'ye sabitlemek için sıcaklığı 19,5 dakikada 60 °C'ye yükseltin. Her nöbet tarama denemesi 30 dakika sürer.
- Farede nöbet geçirirse (ses çıkarırsa, baş sallarsa, ön bacak klonusu, arka bacak ekstansiyonu, yan tarafına düşerse veya genelleştirilmiş tonik/klonik konvülsiyonlar yaşarsa), aşağıdaki bilgileri kaydedin.
- Rektal sıcaklık termometresinden nöbet sırasında farenin vücut sıcaklığını (nöbet eşiği sıcaklığı) kaydedin.
- Fare tarafından görüntülenen baş sallama, ön bacak klonusu, arka bacak ekstansiyonu, yana düşme ve/veya genelleştirilmiş tonik/klonik nöbetler (GTCS) gibi nöbet davranış özelliklerini kaydedin.
- Fareyi hızlı ama nazikçe hazneden alın ve adım 1.6.
'de hazırlanan soğutma pedinin üzerine yerleştirin.
not: Bir fare Racine ölçeği 5 nöbetleri geçiriyorsa ve kontrolsüz sıçrama sergiliyorsa, hayvanı ısı odasından almak ve dışarıdaki soğutma pedine aktarmak zor olabilir. Bununla birlikte, tipik bir ısıya bağlı nöbet 30 s ila 60 s arasında sürer, bu nedenle, fare ısı odasından çıkarılmalı ve ısıya bağlı nöbet atağının başlamasından sonraki 60 saniye içinde soğutma pedine konulmalıdır.
- Kurtarma kafesine aktarmadan önce fare vücut sıcaklığının 36-37 °C'ye düşmesini bekleyin. Kurtarma kafesine aynı anda yalnızca bir fare yerleştirilir.
not: Henüz ısıya bağlı tarama için kullanılmamış fareleri, ısıya bağlı nöbet deneyi denemesini zaten deneyimlemiş olan fare ile karıştırmayın.
- Nazikçe ve dikkatlice, rektal probu fareden çıkarmak için fare kuyruğu ile rektal prob teli arasındaki bandı bir makasla kesin.
- Bir sonraki denemeye hazır tutmak için rektal probun metal ucunu %70 alkol ve yumuşak doku mendilleriyle silerek temizleyin.
- Fareyi ev kafesine geri döndürmeden önce, normal aktivitesine (yürüme, tımar etme vb.) devam edene kadar kurtarma kafesinde fareyi gözlemlemeye devam edin. Bu, bu fare için deney denemesinin SONU'nu işaret ediyor.
- Testten sonra canlı ve test oturumundan kurtarılan veya ölü olan hayvan durumunu kaydedin. Kontrolsüz sıçrama ve jeneralize tonik / klonik nöbetleri içeren yüksek yoğunluklu nöbetler bazen farenin ölümüyle sonuçlanabilir.
- Bir fare 30 dakikalık gözlem süresi içinde ısıya bağlı nöbetler geçirmezse veya farenin vücut ısısı 44 °C'ye ulaşırsa, fareyi ısı odasından çıkarın ve farenin vücut ısısı 36-37 °C'ye dönene kadar soğutma pedinin üzerine yerleştirin.
- Fare ısı odasının sıcaklığını 50 °C'ye sıfırlayın ve dijital sıcaklık kontrol cihazındaki ekran sıcaklığı 50 °C'yi gösterene kadar dengelenmesine izin verin.
- Bireysel fare denemeleri arasında koçan yatağını değiştirin.
