Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Primer antikor ve biyositin boyanması
(1. Gün)
NOT: Aşağıdaki immün boyama prosedürü serbest yüzen bölümler içindir ve tüm inkübasyon adımları için bir çalkalayıcı üzerinde düşük hızda (2 devir/dk, rpm) sürekli çalkalama gerektirir.
- Dokuyu 3x, her biri 0.1 M PBS'de (pH = 7.4) 10 dakika boyunca yıkayın.
NOT: 0.1 M PBS ticari olarak satın alınabilir veya laboratuvarda aşağıdaki şekilde yapılabilir (1 L yapar): 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 ve 0.24 g KH2PO4 1 L dH2O.
NOT: İstenen nörokimyasal belirteç biliniyorsa, bir protein/peptit için boyama, biyosit boyama (adım 1.2 - 1.4) ile aynı anda gerçekleştirilebilir. Yalnızca biyosit için boyama yapıyorsanız, adım 1.5'e geçin.
- İSTEĞE BAĞLI:% 10 Bloke Edici Serum ile Blok (BS; normal keçi serumu (NGS)% 0.3 Triton X-100 içinde RT'de 1 saat boyunca PBS'de seyreltilir).
NOT: Her kuyucuk aynı hacimde çözelti almalıdır; önerilen hacim 250 - 500 μL/kuyu arasındadır. Bloke edici serumun seçimi, ikincil antikorların yükseltildiği türe dayanır (örneğin, NGS, boya konjuge keçi anti- (ilgili birincil antikor türleri) için kullanılır). İmmün leke kesitleri için farklı türlerde yetiştirilen ikincil antikorların kullanılması ihtiyacı ortaya çıkarsa, her normal serumun %10'unu bloke edici adım (2)'ye ve primer ve ikincil antikor inkübasyon adımları için her normal serumun %3'ünü dahil edin.
- (İSTEĞE BAĞLI) Primer antikor, CB1R (poliklonal, kobay),% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS ile RT O / N'de 0.1 M PBS'de inkübe edin. CB1R, kannabinoid reseptörü tip 1 ekspresyonunu tanımlamak için kullanılır.
NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve biyosit dolgusunu ortaya çıkarmak için gerekli değildir. Şekil 2, ilk boyama işlemi sırasında biyosit ve CB1R için etiketlenmiş bir bölümü göstermektedir. RT'de O/N inkübasyonu, primer antikorların çoğu için yeterlidir; bununla birlikte, CB1R dahil olmak üzere bazı primer antikorlar, 3-5 gün inkübasyon gerektirir. İnkübasyonun 1 günden daha uzun olması gerekiyorsa, 4 ° C'de inkübe edilmesi önerilir çünkü Triton X-100 dilimleri geçirgen hale getirebilir ve oda sıcaklığında uzun süreli inkübasyon sırasında dokunun parçalanmasına yol açabilir. İkincil antikorun özgüllüğü için bir kontrol olarak, her deney serisi için en az bir bölümde birincil antikor içermeyen bir negatif kontrol ekleyin. Negatif kontroller için, birincil antikor atlanır, ancak 0.1 M PBS ve BS'de% 0.3 Triton X-100 eklenir.
(2. Gün)
- Beyin bölümlerini 3x, her biri 0.1 M PBS'de (pH = 7.4) 10 dakika boyunca yıkayın.
- Streptavidin kırmızı boya konjugatındaki bölümleri (konsantrasyon: 1: 1.000; uyarma: görünür kırmızı spektrumda emisyon ile 594 nm) karanlıkta 4 ° C O / N'de 0.1 M PBS'de% 0.3 Triton X-100 ve% 3 BS ile inkübe edin (alüminyum folyoya sarılmış) biyositini ortaya çıkarmak için. İSTEĞE BAĞLI: İkincil bir antikor, keçi anti-kobay (konsantrasyon: 1:500; uyarma: 488 nm ve yeşil emisyon) ekleyin, yukarıdaki inkübasyon adım 1.3'teki isteğe bağlı birincil inkübasyonu takiben yapılır.
NOT: İkincil bir antikor, yalnızca isteğe bağlı birincil antikor boyaması (adım 1.3) gerçekleştirilirse gerekli olacaktır. Biyositini görselleştirmek için, daha ince aksonları ayrıntılı ve daha iyi kontrastla görselleştirmeye yardımcı olduğu için kırmızı emisyon spektrumuna sahip bir streptavidin-florofor konjugatı önerilir (Şekil 1 - 3).
(3. Gün)
- Beyin bölümlerini 3x, her biri 10 dakika boyunca 0.1 M PBS'de (pH = 7.4) yıkayın.
- Floresanı korumak ve gelecekte yeniden boyamayı kolaylaştırmak için, bölümleri su bazlı bir montaj ortamına monte edin ve lamel kenarlarını şeffaf oje ile kapatın.
NOT: Ojeyi slayttan çıkarmada zorlukları, küf istilasını ve cam slayttan sızan montaj ortamı nedeniyle doku dehidrasyonunu önlemek için bölümleri mümkün olduğunca erken boyamak en iyisidir. PBS'de %0.02 sodyum azid kullanılarak mikrobiyal kontaminasyon önlenebilir.
DİKKAT: Sodyum azid, su ile temas ettiğinde oldukça toksik ve yanıcıdır. Lütfen tehlikeli kimyasalların taşınması ve bertarafı için standart çalışma prosedürlerine bakın.
(4 - 7. günler)
- Biyosit dolu nöronları kırmızı ve nörokimyasal belirteçlerde (CB1R) ortaya çıkarmak için 594 ve 488 nm'de ve 20X veya 40X büyütmede uyarma ile konfokal görüntüleme gerçekleştirin. Birlikte etiketlemeyi değerlendirin (Şekil 2).
- Fotoağartmayı önlemek ve tüm nöronun aksonal ve dendritik arborslarının konfokal görüntü yığınlarını elde etmek için kamera pozlamasını 100 ms'den daha düşük bir değere ayarlayın. Nöronal morfolojiyi yeniden yapılandırmak için konfokal görüntü yığınlarını ve nöron izleme yazılım paketlerini kullanın.
