1. Rektal aspirasyon biyopsilerinin hazırlanması (RSB) kesitleri
- Dokuyu sabitlemek için rektal aspirasyon biyopsilerini 6 saat boyunca% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Doku hacminden 5 kat daha fazla fiksatif hacim kullanın.
- Patolojik doku kurutucusunu kullanarak dokuyu 11 saat boyunca kurutun. Programlanan tüm süreç aşağıdaki 5 adımdan oluşur:
- Dokuyu formaldehit içine yerleştirin ve 1 saat sabitleyin.
- Dokuyu 4 saat boyunca% 75 etanol içine yerleştirin.
- Dokuyu mutlak etanole yerleştirin (iki değişiklik, her biri 1 saat).
- Dokuyu mutlak etanole yerleştirin (iki değişiklik, her biri 30 dakika).
- Dokuyu ksilen içine yerleştirin (her biri 1 saat olmak üzere üç değişiklik).
- Dokuyu parafin mumuna (58-60 °C) yerleştirin (her biri 1 saat olmak üzere üç değişiklik). RSB dokularını parafin bloklarına gömün.
- Parafin bloklarını, doku tam bir kesit düzlemi ile tamamen açığa çıkana kadar bir mikrotom kullanarak kesin.
- Blokları bir mikrotom ile 0,4 μm'lik bölümler halinde kesin.
- Bölümlerin düz bir tabağa yayılmasını sağlamak için bölümleri 45-50 °C suya birkaç saniye koyun.
- Parafin bölümlerini slaytlara aktarın.
- Slaytları 60 °C fırında 3-5 saat pişirin. Antijenlerin kaybına yol açabilecek çok uzun süre pişirmekten kaçının.
- Deparafinize edilmiş slaytları ksilene yerleştirin (2 değişiklik, her biri 15 dakika).
- Slaytları mutlak etanol, %95, %80 ve %75 etanol ile her biri 5 dakika boyunca nemlendirin. Ardından, ters ozmoz (RO) ile arıtılmış suda 5 dakika daha durulayın.
2. Antijen Alımı
- 4 mL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) antijen alma tamponunu 200 mL RO ile saflaştırılmış su ile karıştırarak kalretinin alımı için çalışma seyreltmeleri yapın. 1 mL sitrik asit sodyum sitrat tamponunu (100x) 99 mL RO ile saflaştırılmış su ile karıştırarak S100 ve Protein Gen Ürünü 9.5 (PGP9.5) alımı için çalışma seyreltmeleri yapın.
NOT: Calretinin, tercihen EDTA geri alma çözeltisi ile alınabilir. Bununla birlikte, sitrik asit sodyum sitrat tamponu, S100 ve PGP9.5'in alınması için daha uygundur.
- Slaytları bir coplin boyama kavanozuna yerleştirin. Kavanozu geri alma solüsyonu ile doldurun ve önceden ısıtılmış kaynar su banyosuna koyun. 20 dakika kaynattıktan sonra kavanozu su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına soğumaya bırakın. Soğutma işlemi yaklaşık 10 dakika sürer. Slaytları çıkarın ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile bir kez nazikçe durulayın.
- Dokunun etrafına keçeli kalemle bir daire çizin ve aşağıdaki işlemler için ıslak bir kutu hazırlayın.
3. Engelleme
- 3 mL %30 H2O2 ile 27 mL RO saflaştırılmış su ile karıştırarak çalışma seyreltmeleri yapın.
- Peroksidazları bloke etmek için dokuya damla damla %3 H2O2 solüsyonu damlatın. Daireden taşmamasını sağlamak için H2O2 çözümünü hemen ekleyin. Peroksidazları 37 °C'lik bir inkübatörde 20 dakika bloke edin.
- Slaytları PBS ile nazikçe durulayın (her biri 5 dakika olmak üzere üç yıkama).
- Slaytları 37 ° C'de 20 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini (BSA, 1.5 g BSA tozunun 30 mL RO ile saflaştırılmış su ile karıştırılmasıyla hazırlanır) ile bloke edin.
NOT:NOT: %3 hidrojen peroksit ile bloklama, spesifik olmayan lekelenmenin %95'ini önleyebilir ve %5 BSA ile bloklama, spesifik olmayan lekelenmenin diğer %5'ini önleyebilir. Güvenilir bir sonuç elde etmek için iki yöntemi birleştirin.
4. Antijen-antikor Reaksiyonu
- % 5 BSA'yı çıkarın ve slayta 50 μL primer antikor (kalretinin, S100 veya PGP9.5) ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Slaytı PBS ile yıkayın (her biri 3 dakika olmak üzere üç kez).
- Bölüme 50 μL polimer arttırıcı (reaktif A; bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin ve 37 °C'lik bir inkübatörde 20 dakika inkübe edin. Ardından, slaytı PBS ile yıkayın (her biri 3 dakika olmak üzere üç kez).
- Bölüme 50 μL ikincil antikor B (keçi anti-tavşan / fare IgG ikincil antikoru) ekleyin ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika inkübe edin. Bölümü PBS ile yıkayın (üç kez, her biri 5 dakika).
5. 3,3-Diaminobenzidin ve Hematoksilen Boyama
- 1,5 mL'lik bir tüpe 850 μL RO ile saflaştırılmış su ekleyin ve boyama reaktiflerini ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) A, B ve C sırasına göre. Toplam 1 mL 3,3-diaminobenzidin (DAB) çalışma çözeltisi elde etmek için her reaktiften 50 μL ekleyin. Çökeltiler varsa, filtrasyondan sonra çözeltiyi kullanın.
- Doku bölümüne bir damla DAB çalışma solüsyonu ekleyin ve 3-10 dakika boyayın. Kahverengi lekelenme tespit edilene kadar slaytları DAB'da oda sıcaklığında inkübe edin. Parlak alan mikroskobu kullanarak dikkatlice izleyin. DAB çalışma solüsyonunu ışıktan uzak tutun. Ardından, slaytı PBS ile 5 dakika boyunca yıkayın.
- Çekirdekleri yaklaşık 1 dakika boyunca lekelemek için bir damla hematoksilen ekleyin. Daha sonra coplin kavanozunu tutun ve fazla boya çıkana kadar yaklaşık 30-40 saniye su altında yıkayın. Doku bölümlerine zarar vermemeye dikkat edin.
- RSB slaytlarını 25-30 saniye boyunca PBS içeren bir coplin kavanozuna daldırın. Daha sonra, 10 s boyunca% 1 hidroklorik asit-etanol içinde farklılaştırın. Slaytları PBS ile 1 dakika yıkayın.
- Slaytları hidrasyon sırasının tersine göre kurutun: %75, %80, %95 ve mutlak etanol (her biri 5 dakika).
- Slaytları ksilene maruz bırakın (2 değişiklik, her biri 5 dakika).
- Ultraclean montaj kullanarak lamel monte edin. Mikroskop kullanarak görselleştirmeden önce slaytların kurumasını bekleyin.