Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Diseksiyon solüsyonlarının ve yapay beyin omurilik sıvısının hazırlanması
- Karbojen (%95 O2/%5 CO2) ile 5 dakika boyunca hava taşı kabarcıklı difüzörler (akvaryumlar için havalandırıcılar) ile karbojenat ultra saf su (18.2 MΩ·cm dirençle filtrelenmiş su).
Not: Hava taşları, standart silikon boru ile karbojen tankının regülatörüne bağlanabilir. Hava taşları mevcut değilse, silikon borunun ucunu kapatın ve karbojen gazının dışarı çıkmasını ve çözeltiyi karbonjene etmesini sağlamak için contada küçük delikler açın.
- Tablo 1'deki çözünen maddeleri ultra saf suda çözerek bir diseksiyon çözeltisi hazırlayın. Çözünmesine yardımcı olmak için en az 5 dakika boyunca karbojene edilmiş bir çözeltiye CaCl2 ekleyin.
Not: Alternatif olarak, doymamış bir çözeltide kolayca çözünebilmesi için önce CaCl2 ekleyin. Sıvı formdaki çözelti 300 - 320 mOsm/L olmalı ve karbojen ile doyurulduktan sonra pH değeri 7.4 olmalıdır.
- Diseksiyon solüsyonunu 0 - 4 °C'ye soğutun. Solüsyonu gece boyunca buzdolabında bırakın veya solüsyonu 1 saat dondurucuda bekletin ve sıcaklığı sürekli olarak izleyin.
Not: Diseksiyon solüsyonu 3 geceye kadar saklanabilir; Daha sonra atın.
- Kullanmadan önce diseksiyon solüsyonunu 5-10 dakika karbojenize edin.
Not: İdeal olarak, çözelti ya sulu kar olarak görünmeli ya da kullanımdan önce sulu kar'a geçiş yapmalıdır.
- Tablo 2'deki çözünen maddeleri ultra saf suda çözerek kemirgen yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın. ACSF çözeltisini kullanıma kadar 35 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosundayken karbojene edin. Çözünmesine yardımcı olmak için en az 5 dakika boyunca karbojene edilmiş bir çözeltiye CaCl2 ekleyin.
Not: Alternatif olarak, doymamış bir çözeltide daha kolay çözünebilmesi için önce CaCl2 ekleyin. Sıvı formdaki çözelti 290 - 320 mOsm/L olmalı ve karbojen ile doyurulduktan sonra pH'ı 7.4 olmalıdır. Çözeltiler, deneylerin süresine bağlı olarak 1, 2 veya 4 L'lik hacimlerde yapılmalıdır. Tam bir gün (8 saat) deney için 4 L yapın. ACSF her gün taze yapılmalıdır; 1 günden daha uzun süre saklamayın.
2. Beyin dokusunu toplamak için fare diseksiyonu
- Hayvan diseksiyonları için gerekli tüm araç ve gereçleri toplayın. Hayvan diseksiyonlarına hazırlanmak için çalışma alanını ayarlayın.
- Boş olmadığından emin olmak için karbojen tankını (%95 O2/%5CO2) kontrol edin. Kalan 500 psi'den daha az basınç varsa, deneylerden önce gaz tüpünü değiştirin.
- Vibratomu (titreşimli bıçaklı doku dilimleyici) üreticinin kullanım kılavuzuna göre kalibre edin. Vibratom ayarını 1 mm kesme genliğine ve 0,12 mm/sn kesme hızına sahip olacak şekilde ayarlayın.
Not: En uygun ayarlar, her bir titreşimli doku bıçağı kesici için farklı olabilir; Ancak genel olarak genlik yüksek ve kesme hızı düşük olmalıdır.
- Beyin dilimi kuluçka odasını (yani , beyin dilimi koruyucusu) ACSF ile doldurun ve karbojen ile köpürtün. Ardından inkübasyon odasını 35 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna yerleştirin.
- 13 gün (p13) ile 21 gün (p21, burada p0 doğum tarihidir) arasında her iki cinsiyetten bir yavru fare edinin.
- Fareyi intraperitoneal sodyum pentobarbital (55 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile uyuşturun. Fare derin bir şekilde uyuşturulduktan sonra, ayak parmağını sıkıştırma refleksinin yokluğuyla belirtildiği gibi, farenin başını tek bir hızlı hareketle kesmek için derhal veteriner onaylı bir giyotin aleti kullanın.
Not: Sodyum pentobarbital enjeksiyonunu kurumsal yönergeler tarafından önerilen prosedürlere göre hazırlayın.
- Kafası kesilmiş kafayı stabilize etmek için farenin burnunu tutun ve kafatasını ortaya çıkarmak için farenin gözleri arasından başlayarak ve kafa derisinin tüm uzunluğu boyunca nazikçe bir orta hat kesisi yapın. Kafatasının tıraş bıçağının uyguladığı basınçla sıkıştırılmadığından emin olun. Kesim hassasiyetini artırmak için tıraş bıçağının kenarının köşesini kullanın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için parmaklarınızı kullanarak farenin kafa derisinin kanatlarını açın. Ardından, kafatasının orta hattı boyunca bir kesi yapmak için bir tıraş bıçağının kenarının yeni köşesini kullanın; Serebral korteks ile herhangi bir temastan kaçınmak için dikkatli olun.
- Kafası kesilmiş kafayı stabilize etmek için farenin göz yuvalarına kıymık forseps yerleştirin ve soğuk (0 - 4 °C) diseksiyon solüsyonu ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Başın diseksiyon solüsyonuna tamamen daldırıldığından emin olun.
- Farenin kafa derisini nazikçe soymak, burun kemiğini soyarak çıkarmak ve kafatasının arkasını (kaudal tarafı) çıkarmak için ikinci bir kıymık forseps seti kullanın.
Not: Yavru farelerin burun kemiği çok yumuşaktır ve kolayca kırılır.
- Optik sinirleri, trigeminal sinirleri ve omuriliği kesmek için bir mikro spatula kullanın. Ardından, beyni kafatasından nazikçe ayırmak için mikro spatulayı kullanın. Beyni, diseksiyon solüsyonu ile doldurulmuş Petri kabına tamamen batırılmış halde bırakın.
3. Somatosensoriye-motor korteksten kortikal dilimlerin hazırlanması
- Vibratomun tampon tepsisini ~ 150 mL soğuk (0 - 4 ° C) diseksiyon solüsyonu ile doldurun.
Not: İsteğe bağlı olarak, dilimleme işlemi sırasında düşük bir sıcaklığı korumak için tampon tepsisini gerekene kadar dondurucuda tutun.
- Anında yapışkan yapıştırıcı kullanarak beyin dokusunu fareden vibratom aşamasına (numune tutucu/tepsi) yapıştırın. Fareler için, beynin küçük bir kaudal kısmını (yani , beyincik) kesin, böylece numune tutucuya kolayca düz bir şekilde yapıştırılabilir (beynin rostral tarafının tavana bakmasına izin verir).
Not: Alternatif olarak, beynin dorsal tarafı numune tutucuya yapıştırılarak yatay fare beyin dilimleri hazırlanabilir (beynin ventral tarafı tavana bakmalıdır).
- Numune tutucuyu (beyin dokusuyla birlikte) nazikçe tampon tepsisine yerleştirin. Beynin sırt kısmının vibratomun bıçağına baktığından emin olun.
Not: Beynin havaya maruz kaldığı süreyi en aza indirmek çok önemlidir.
4. Beyin dokusu kesitleme ve toplama
- Beyni, dorsalden ventral yöne vibratom kullanarak 450 μm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Dilimlerken beynin numune tepsisine tamamen bağlı kaldığından emin olun.
- Koku ampulünü çıkarmak için fare beyninde ilk kesimi yapın. Ardından, somatosensoriyel motor alan gözlenene kadar (koku soğancağı ile bregma arasında yaklaşık olarak yarıda bulunur) sonraki kesintileri yapın.
Not: İsteğe bağlı olarak, beynin korpus kallozum görünümünde korpus kallozum görünene kadar beyni daha ince (200 μm) dilimler halinde dilimleyin, bu da somatosensoriye-motor alanın yakın olduğunu gösterir.
- Somatosensoriyel motor alanı içeren koronal dilimleri (450 μm) toplamak için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın ve bunları soğuk (0 - 4 °C) diseksiyon solüsyonu içeren bir Petri kabına daldırın.
- Yeni bir tıraş bıçağı kullanın ve dilimlerdeki fazla dokuyu kesin. Farelerden alınan koronal dilimler için, neokortikal komisürün hemen altında enine bir kesim yapın (, yani , korpus kallozum). Testere hareketiyle kesmeyin; Bıçağın dokuya baskı uygulaması ve dokuyu nazikçe ayırmak için bir detaylandırma fırçası kullanması yeterlidir. Koronal dilimin hareketini en aza indirdiğinizden emin olun.
- Neokorteksi içeren koronal dilimlerin dorsal kısmını (katman 1 - 6) bir an için (~ 1 s) ılık (35 ° C) ACSF ile doldurulmuş ikinci bir Petri kabına aktarmak için geniş delikli bir transfer pipeti kullanın. Ardından, dilimleri derhal ılık (35 ° C) karbonjene ACSF içeren bir inkübasyon odasına aktarın.
Not: ACSF ile Petri kabına transferin amacı, geniş delikli pipet ile beyin dilimlerini aktarırken diseksiyon solüsyonunun inkübasyon odasına transferini en aza indirmektir. Farklı beyin dilimlerini düzenli tutmak için kuluçka odasının çoklu kuyularını kullanın.
- Beynin geri kalanını ve hayvan karkasını kurumsal yönergelere göre atın.
5. Kuluçka ve bakım
- Beyin dilimlerini 35 °C'de 30 dakika boyunca inkübasyon odasında hafifçe batırılmış halde bırakın. Ardından, inkübasyon odasını su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığına (20 - 25 °C) dönmesine izin verin. Elektrofizyolojik kayıtlar yapmadan önce beyin dilimlerinin iyileşmesi için 1 saat bekleyin.
Not: Kuluçka odasındaki beyin dilimlerinin altında toplanan hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları, doku hasarına neden olan hava arayüzleridir. Fare beyin dilimleri, ACSF ile iyi karbonjene edilmiş bir inkübasyon odasında 6-8 saat boyunca muhafaza edilebilir.
6. Yüzeysel kortikal tabakanın elektrofizyolojik kayıtları
Not: Beyin dilimlerinden hücre dışı yerel alan potansiyeli (LFP) kayıtlarında iktal olaylar gözlenir. Beyin diliminin LFP'si, arayüz tipi bir oda veya batık çok elektrotlu dizi (MEA) sistemi ile gözlemlenebilir ve kaydedilebilir.
- Bir beyin dilimini, bir diş cımbızı kullanılarak yerinde tutulan biraz daha büyük, önceden kesilmiş lens kağıdına taşımak için geniş delikli bir transfer pipeti veya detaylandırma fırçası kullanın. Lens kağıdını (beyin diliminin üzerinde durduğu) kayıt odasına aktarın ve bir arp ekranı ile yerine sabitleyin.
- Sıcak (35 °C), karbojene ACSF, kayıt odasından beyin dilimi üzerinden 3 mL/dk (~1 damla/sn) hızında sızdırın. Kayıt odasının 33 - 36°C olduğundan emin olmak için dijital bir termometre kullanın.
- 1 - 3 MΩ empedanslı cam elektrotları bir çektirme kullanarak borosilikat cam borudan (dış çapı 1,5 mm) çekin. Bir Hamilton şırınga kullanarak cam elektrotları ACSF (~ 10 μL) ile doldurun. Uç hasar görürse elektrodu hemen atın.
Not: Gümüş teli ağartın (5 dakika) ve kayıtlar sırasında gürültüyü ve kaymayı en aza indirmek için gümüş telin yalnızca minimum bir kısmının (, yani , uç) ACSF geri dolgulu cam elektrotlara daldırılmasına izin verin. Gerekirse bir Hamilton şırınga ile cam elektrottaki fazla ACSF'yi çıkarın.
- Manuel manipülatörler kullanarak kayıt cam elektrodunu yüzeysel kortikal katmana (2/3) doğru bir şekilde yönlendirmek için 20X stereo mikroskop kullanın. Beyin diliminin elektriksel aktivitesini standart yazılım ile bir bilgisayara kaydedin/görüntüleyin.
Not: Canlı (yüksek kaliteli) beyin dilimleri, optogenetik doku için uygulanan elektriksel uyaranlara (100 μs, 30 - 300 μA) veya ışık darbelerine (30 ms, 10 mW/mm2) yanıt olarak sağlam bir uyarılmış potansiyel sergileyecektir.
7. Nöbet benzeri aktivitelerin başlatılması
- Beyin dilimi üzerine 100 μM 4-aminopirimidin (4-AP) içeren ACSF perfüz. 100 mM 4-AP'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 80 mg 4-AP'yi 8.5 mL suda çözün. 100 μM 4-AP ile bir ACSF perfüzatı elde etmek için 100 mL ACSF'ye 100 μL 100 mM 4-AP stok çözeltisi ekleyin.
Not: Alternatif olarak, beyin dilimini perfüze etmek için ilave Mg2+ içeren modifiye edilmiş bir ACSF çözeltisi olan Zero-Mg2+ ACSF ( ACSF () kullanın. İktal olayların ortaya çıkması için ortalama süre 15 dakikadır; Bununla birlikte, bazı beyin dilimleri için 40 dakika kadar sürebilir.
8. İsteğe bağlı nöbet oluşturma: optogenetik fareler için optogenetik bir strateji
- Bir iktal olayı başlatmak için kısa (30 ms) mavi (470 nm) ışık darbesi (minimum 1 mW/mm2 çıkış yoğunluğu ile) uygulayın. 1.000 μm çekirdek çaplı bir optik fiberi (0,39 NA) doğrudan kayıt bölgesinin üzerine yerleştirmek için manuel bir manipülatör kullanın.
Not: Foto-stimülasyon hızını, iktal olay oluşumunun istenen hızıyla eşleşecek şekilde ayarlayın (, yani , her 50 saniyede bir 1 darbe). Bununla birlikte, oran, iktal olayların meydana geldiği içsel orandan aşırı derecede abartılamaz.
Tablo 1: Diseksiyon çözeltisi tarifi. Bunlar, 1 L veya 2 L hacimler yapmak için talimatlardır. MW = çözünen maddenin moleküler ağırlığı.
| # | Reaktif | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | Sükroz | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | Sodyum Bikarbonat (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Dekstroz (D-glikoz) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Potasyum Klorür (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Magnezyum Sülfat (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Sodyum fosfat monobazik monohidrat (H2NaPO4}·H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | Kalsiyum Klorür (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
Tablo 2: Kemirgen yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) tarifi. Bunlar 2 L veya 4 L hacim yapmak için talimatlardır. MW = çözünen maddenin moleküler ağırlığı.
| # | Reaktif | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Sodyum Klorür (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Sodyum Bikarbonat (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dekstroz (D-glikoz) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Potasyum Klorür (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Magnezyum Sülfat (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | Sodyum fosfat monobazik monohidrat (HNaPO4}·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Kalsiyum Klorür (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
Tablo 3: Sıfır-Mg2+ kemirgen yapay beyin omurilik sıvısı (Sıfır-Mg2+ ACSF) tarifi. Bunlar 2 L veya 4 L hacim yapmak için talimatlardır. MW = çözünen maddenin moleküler ağırlığı.
| # | Reaktif | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Sodyum Klorür (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Sodyum Bikarbonat (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Dekstroz (D-glikoz) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Potasyum Klorür (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Magnezyum Sülfat (MgSO4·H2O) | Nominal Olarak Ücretsiz | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Sodyum fosfat monobazik monohidrat (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Kalsiyum Klorür (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |