Farelerde Pentilentetrazol ile İndüklenen Epileptik Nöbet Modelinin Kurulması

Özet

Kaynak: Shimada, T., et al. Pentiletetrazol ile İndüklenen Çıra Fare Modeli. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, bir GABA-A reseptör antagonisti olan pentilentetrazol (PTZ) enjeksiyonları kullanılarak farelerde epilepsiyi indükleme sürecini göstermektedir. PTZ'nin tekrarlanan intraperitoneal uygulaması, klorür iyonu akışını inhibe ederek, inhibitör nörotransmisyonu bozarak ve nöbetleri tetikleyen nöronlarda hipereksitabiliteye yol açarak nöbet eşiğini aşamalı olarak düşürür. Bu süreç, kronik epilepsiyi taklit eden tutuşma ve spontan nöbetlerin gelişmesine neden olur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Pentiletetrazol (PTZ)

hazırlanması

1. 2 mg / mL PTZ'yi steril% 0.9 (a / h) NaCl içinde çözün. Kullanım gününde PTZ'yi hazırlayın.

2. PTZ enjeksiyonu

1. Tüm deneyleri 09:00 ile 12:00 (öğlen) saatleri arasında gerçekleştirin.
2. Hayvanın vücut ağırlığını ölçün.
3. Hayvanı alışma için bir gözlem odasına yerleştirin.
4. Alışma süresi boyunca (3 dakika), hayvanın vücut ağırlığına ve önceden belirlenen enjeksiyon dozuna bağlı olarak enjeksiyon için PTZ çözeltisinin hacmini hesaplayın.
   NOT: Örneğin, 35 mg/kg PTZ kullanıldığında, 25 g ağırlığındaki bir fare için 0,875 mg PTZ gerekir (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Bu nedenle, 437.5 μL 2 mg / mL PTZ çözeltisi enjekte edilmelidir (0.875 mg / 2 mg / mL = 0.4375 mL). PTZ'nin enjeksiyon dozu, fare genotipine ve suşuna bağlıdır. Yabani tip C57BL / 6 fareler için, ilk deneme için 30-35 mg PTZ / kg vücut ağırlığı dozu önerilir. PTZ'ye duyarlılık, kullanılan fare türüne bağlıdır. Enjeksiyon dozu, deneyin amacına göre değişir.
5. PTZ'yi 27 gauge iğneye bağlı 1 mL'lik bir şırınga ile intraperitoneal olarak hayvanın karnının sol veya sağ çeyreğine enjekte edin. Orta hatta enjekte etmekten kaçının.
   1. Aynı pozisyonda tekrarlanan enjeksiyonlardan kaçının.
6. PTZ uygulamasından sonra 30 dakika boyunca hayvan davranışlarını gözlemleyin (Şekil 1A) ve anormal davranışı aşağıda gösterildiği gibi sınıflandırın ve puanlayın. Mümkünse, hayvanları enjeksiyondan 24 saat veya en az 6-10 saat sonra, özellikle nöbet şiddet skoru 3 veya üzerine ulaştığında gözlem altında tutun.
   1. Hayvanlarda 30 dakikalık gözlem süresinin ötesinde herhangi bir hafif nöbet veya davranış değişikliğine dikkat edin. Bu uzun süreli gözlem süresi, epilepside kronik provoke edilmemiş nöbetlerin oluşumunda subkonvülsif bir PTZ dozunun özellikle önemli ve tam bir etkisini ele alabilir.
   2. Ek olarak, nöbet süresindeki değişiklikler nöbet şiddeti ile ilgili olduğundan, gözlemlenen her nöbetin nöbet süresini ölçün. Ayrıca, PTZ enjeksiyonundan sonraki ilk nöbetin gecikmesi, toplanması gereken bir diğer önemli önlemdir. Nöbet sıklığının, süresinin ve latansının izlenmesi, nöbet sonrası moleküler çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
7. Her gün PTZ enjekte edin (Şekil 1A). Enjeksiyon sayısı deneyin amacına bağlıdır. Temsili örnekler aşağıdaki gibidir.
   1. Tamamen tutuşmuş hayvanlar oluşturmak için, bir hayvan 5 puanlı bir nöbet geçirdiğinde (tonik-klonik nöbet), enjeksiyonu ek üç uygulama içinde bitirin. Bu durumda, nöbet skoru art arda üç uygulama için artmazsa enjeksiyon dozunu arttırın. Her hayvan farklı sayıda ve dozda PTZ enjeksiyonu alabilir.
   2. Anti-epilepsi ilaçlarının değerlendirilmesi ve genetiği değiştirilmiş farelerin fenotipinin incelenmesi de dahil olmak üzere, PTZ'ye karşı savunmasızlığı değerlendirmek için her koşulda PTZ enjeksiyonunun sayısını ve dozunu sabitleyin. Tüm hayvanlara aynı sayıda PTZ enjeksiyonu yapın; Toplam 8 ila 12 enjeksiyon önerilir. Bir hayvan ölürse, nöbet skoru 6 olarak gösterilmelidir.
   3. Epileptik nöbetlerde meydana gelen histopatolojik değişiklikleri incelemek için 10 veya daha fazla enjeksiyon için yüksek bir nöbet skorunu (4 veya 5) korumak için gerekli enjeksiyon dozunu belirleyin. Bu durumda, toplam enjeksiyon sayısı 25 ila 30 arasında olmalıdır. Nöbet skoru 5'e ulaşırsa enjeksiyon dozunu azaltın. Nöbet skoru 3 veya altına düşerse, enjeksiyon dozunu artırın.

Sonuçlar

Şekil 1: Protokolün kısa açıklaması. (A) PTZ aracılı çıranın şematik gösterimi. (B) İlgili nöbet skorları için temsili hayvan davranışlarının çizimleri.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pentiletetrazol	Sigma-Aldrich	P6500
Sodyum klorür	MANAC	7647-14-5
Fare	CLEA Japonya		C57Bl/6NJcl, doğum sonrası 8 hafta, erkek
Şırınga (1mL)	Terumo	SS-01T
İğne (27G x 3/4 ") (0,40 x 19 mm)	Terumo	NN-2719S
Tartı kantarı	Mettler	PE2000	Bu ürün, üretimi durdurulan bir üründür. A & D şirketinden FXi-12-JA ile neredeyse FX-2000i'ye eşdeğer.