Bir sıçan modelinde orta serebral ve ortak karotis arter tıkanıklığı yoluyla iskemiyi indüklemek

Özet

Kaynak: Wayman, C. et al., Sürekli Özürlülük ile Kortikal İskemiyi İncelemek İçin Yaşlı Sıçanlarda Ortak Karotis Arter Oklüzyonu ile Kalıcı Distal Orta Serebral Gerçekleştirme. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, iskemik inmeyi modellemek için yaşlı sıçanlarda ortak karotis arter veya CCA ligasyonu ile kalıcı distal orta serebral arter oklüzyonu veya MCAO gerçekleştirme prosedürünü göstermektedir. Bu, beyne giden kan akışını engelleyerek nöronal ölüme yol açar ve inme mekanizmalarını ve potansiyel tedavileri incelemek için bir model oluşturur.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Cerrahi

1. 16-18 ayda (250 ila 400 g) dişi yaşlı Lister-Hooded sıçanları kullanın ve 1.5 L / dak O₂'de% 5 izofluran ile anestezi indükleyin. Anestezi indüksiyonunu takiben, izofluran seviyesini azaltın ve ameliyat için yeterli ancak en aza indirilmiş bir derinlikte tutun (, örneğin , %1.5-2). Hayvana bir yüz maskesi ile anestezi verin ve cerrahın izoflurana maruz kalmasını sınırlamak için bir süpürme sistemi kullanın.
   1. Sahte hayvanlarda kraniyotomi dahil olmak üzere tüm prosedürleri uygulayın, çünkü bu prosedür davranışsal eksikliklere neden olabilir. Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) deneylerini tasarlarken deneysel hedefleri göz önünde bulundurun ve kraniyotomiyi kontrol etmek için sahte bir grubun dahil edilip edilmeyeceğine karar verin.
2. Ameliyat öncesi veya perioperatif olarak ağrı kesici uygulayın (Carprieve, 0.25 mg / kg, s. cut).
   1. Stok çözeltisini yapmak için 19 ml steril% 0.9 salin ila 1 ml ekleyin ve 300 g sıçan başına 0.6 ml enjekte edin. Carprieve kullanımı, Carprofen'e göre tercih edilir, çünkü birincisi oda sıcaklığında (RT) stabildir.
3. Cildi açığa çıkarmak için ventral boyun bölgesindeki kürkü ve sağ yarım küredeki temporal bölgeyi tıraş edin. Etanol çubukları kullanarak cerrahi bölgeleri dezenfekte edin.
   1. Kesi yerindeki kürk miktarını en aza indirmek için bu adımı ameliyat alanından uzakta gerçekleştirin.
4. Fareyi, bir ısıtma yastığı üzerinde sırtüstü pozisyonda steril bir örtü ile kaplı bir mantar panoya yerleştirin. Baş ve boynun traş edilmiş bölgelerine lidokain kremi sürün. Homeotermik bir sistemle hayvanın sıcaklığını 36.5-37.5 °C arasında izlemek ve korumak için bir rektal prob yerleştirin.
   1. Kurumayı önlemek için gözlere lacrilube merhem sürün. Trakeal sekresyonları azaltmak için sıçana bir atropin sülfat çözeltisi (deri altından 0.05 ml 600 μg / ml çözelti) enjeksiyonu yapın.
      NOT: Araştırmacılar, kan gazları ve basınç gibi fizyolojik değişkenleri ölçmeyi düşünmelidir.
5. Ameliyata başlamadan önce, tam anesteziyi doğrulamak için arka pençe çimdikleme çekilmesini ve göz kırpma reflekslerini kontrol edin.
6. Diseksiyon mikroskobu altında, bir neşter kullanarak açıkta kalan boynunda 2 cm'lik merkezi bir orta hat kesisi yapın. Tükürük bezlerini her iki taraftaki trakeaya nazikçe lateral olarak hareket ettirin.
7. Bir tarafta ortak karotis arterin üzerini kaplayan cildin etrafına emilmeyen ipek sütür atın. İpek dikişi kullanarak cildi bölgeden nazikçe çekin ve ortak karotis arteri ortaya çıkarmak için cerrahi bant kullanarak bunları mantar panele yapıştırın. İnce forseps kullanarak çevreleyen fasyadan ve vagal sinirlerden arındırılmış arterleri dikkatlice inceleyin.
   1. Bu adım sırasında kas veya vagus sinirlerine zarar vermemeye dikkat edin, çünkü bu beslenmeyi, yutmayı ve nefes almayı bozacaktır.
8. Ana karotis arter açığa çıktıktan sonra, karotidi izole etmek için emilmeyen bir ipek sütür (5/0) kullanın, önce ince forseps ile ters diseksiyon yaparak ve sinirle temas etmemeye dikkat ederek karotidi vagus sinirinden ayırın. Damar dikişle ilmeklendikten (ancak bağlanmadan) sonra, bu adımın geri alınmasını önlemek için dikişin uçlarını cerrahi bant kullanarak birbirine bantlayın. Üstteki cildi geride tutan dikişleri çıkarın.
9. Diğer taraf için tekrarlayın.
10. Ameliyatın geri kalanında dokuları nemli tutmak için yaraya tuzlu suyla ıslatılmış steril bir gazlı bez yerleştirin. Cildi gevşek bir şekilde dikin ve daha fazla dehidrasyonu önlemek için alanın üzerine tuzlu suya batırılmış ek bir gazlı bez yerleştirin.
11. Sıçanları yanal pozisyona yerleştirin ve sağ yörünge ile dış kulak kanalı arasındaki orta noktada deride bir kesi yapın. Mantar panoya tutturulmuş beş adede kadar elastik 3 mm kanca ekartörü kullanarak cildi geri çekin ve ardından kafatasını ortaya çıkarmak için temporalis kasını künt olarak inceleyin.
12. Açık alanın üzerine başparmak tekerleği ayarlı yerçekimi tahrikli bir tuzlu su damlası yerleştirin (akış hızı yaklaşık 2 ml / dak) ve ameliyatın bu aşaması boyunca kemik kalıntılarını gidermek ve açıkta kalan bölgedeki küçük kanamayı temizlemek için bir aspiratör sistemi kurun.
    1. Salin verme memesini kafatasının en yüksek noktasına, kulağın yanına ve aspiratör memesini en alt noktaya yerleştirin. Damarın koteri için herhangi bir kanamanın kaynağını daha iyi görselleştirmek için bölgeye daha fazla tuzlu su sağlamak için kanama sırasında tekerleği ayarlayın ve hayvanların anestezi altında kaldığı süreyi azaltın.
13. Yaklaşık 8.000 rpm'de kaba 1,6 mm elmas kaplı matkap çapağına sahip bir diş matkabı kullanarak açıkta kalan bölgede (yaklaşık 5 mm x 5 mm) bir kraniyotomi gerçekleştirin ve maruz kalan alanı delerken aşağı doğru basınç değil, dairesel ve yanal basınç uygulanmasını sağlayın. Kemik tamamen şeffaf görünecek kadar ince olduğunda, forseps kullanarak çıkarın.
14. İnce forsepsin bir ucunu bir yay oluşturacak şekilde yaklaşık 180° bükerek yapılan ev yapımı bir dural kanca kullanın, durayı dikkatlice açın, hassas ve yırtılması kolay oldukları için geniş yüzeyli kan damarlarından kaçınmak için dikkatli olun.
    NOT: Beynin açıkta kalan bölgesi orta serebral arteri (MCA) ortaya çıkaracaktır; istenen segment yaklaşık 2 mm uzunluğundadır (bkz. Şekil 1).
15. MCA'yı inferior serebral venin geçtiği yerden, arter bifurkasyon noktasına ve daha sonra tamamen tıkanana kadar bir çift diatermi forseps kullanarak MCA'nın kaudal dalları boyunca pıhtılaştırın. 0,25 mm sivri uçlu açılı Kuyumcu diyatermi forseps kullanın.
    1. Arteri tıkarken, bu alanı serin tutmak için tuzlu su akışını gerektiği gibi değiştirin ve pıhtılaştırıcı forsepslerin kan damarına yapışmasını önleyin. Tıkandığında, kan damarı siyah görünür ve kan akışı belirtisi olmamalıdır; Kısmen tıkalı damarlarda kan akımı görülebilir.
    2. Tam tıkanıklığı doğrulamak için bu noktada MCA'yı kesin. Mikrovasküler makas kullanarak, inferior serebral venin MCA'yı geçtiği yerin altını kesin.
    3. Bir sonraki adıma geçmeden önce açıkta kalan alanı tuzlu suya batırılmış bir gazlı bezle örtün.
16. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve karotis arterleri yeniden ortaya çıkarmak için boynuna gevşek bir şekilde bağlanmış dikişi yeniden açın. Şah damarı tıkalı MCA ile aynı tarafta (sağda) karotis etrafındaki ipek dikişte bir düğüm atılarak kalıcı olarak bağlanırken, sol karotis arter 13 mm'lik paslanmaz çelik arter klipsi kullanılarak 125 g basınçla 60 dakika süreyle geçici olarak tıkanır. Bu süre zarfında boyundaki kesiği gevşek bir şekilde dikin ve dehidrasyonu önlemek için üstüne tuzlu suyla ıslatılmış steril bir gazlı bez yerleştirin.
    1. Sırtüstü pozisyon göz önüne alındığında, hayvanın sağ tarafının cerrahın sol tarafında olacağını unutmayın.

Sonuçlar

Şekil 1. Kalıcı distal orta serebral arter oklüzyon modelinin cerrahi kurulumu. Sıçan kraniotomisi için kurulumda kullanılan ekipman, sağ hemisfer ve iç kısım, aspiratörün konumlandırılması ve kraniektomi bölgesi etrafındaki salin damlası için gösterilmiştir. Ayrıca vaskülatür temel özellikleri de gösterilmiştir; Orta serebral arter (kırmızı) ve inferior serebral ven (mavi) gösterilir ve gölgeli ala...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Carprofen	Norbrook	Vm No; 02000/4229	0.25 mg/kg verir
Atropin Sülfat	AmTech	RXATRINJ-100
Alkollü bezler	UHS	20021
Lidokain kremi (Emla)	AstraZeneca	12901	Traşlı boyun ve şakak bölgelerine bezelye büyüklüğünde bir damla uygulayın
Homeotermik Battaniye Sistemi	Harvard Enstrümanları	507222F
Forseps	Güzel Bilim Araçları	11019-12
İzofluran	Abbott	B506
İpek sütürler	Harvard Aygıtı	723288
Koter sistemi	Eschmann
0.25 mm Kuyumcu caurtery forseps	Eschmann	8330349
ince Dumont forseps	Güzel Bilim Araçları	11251-10
Başparmak tahrikli tuzlu su damlası sistemi
Vacusafe aspiratör sistemi	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
16 mm iri baklava kaplı çelik çapaklar		K801 104 016
El tipi diş matkabı	NSK	NSKVMAXVRE (El aleti NSKEX6B)
Vannas Yaylı Makas	Güzel Bilim Araçları	15000-03
Mikrovasküler makas	Dünya Hassas Aletleri	501790
4-0 Vicryl sütürler	Etikon
Vasküler klips ve aplikatör
Ameliyat mikroskobu	Zeiss
Kompakt Anestezi Sistemi İzofluran K/F Tek Gaz	VetTech Çözümleri
Karbon Çelik Neşter bıçakları No. 10	Swann-Morton	201
25g iğneler	Terumo	NN-2525R
Şırıngalar (1 ml ve 5 ml)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Tuzlu Sus (Sodyum Klorür %0,9)	Fresenius Kabi	Pl 08828/0178
Pamuk tomurcukları	Johnson ve Johnson	5.00021E+12	kullanmadan önce sterilize edin
Gazlı bez			kullanmadan önce sterilize edin