Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Şırıngayı Enjeksiyona Hazırlayın
- Lizolesitini fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7.4) içinde% 1'lik bir çözelti içinde çözün ve -20 ° C'de küçük alikotlarda (75 μl) saklayın. Bir şişeyi oda sıcaklığına (RT) çözdürün.
NOT: Lizolesitin çözülmemişse, tüpü düzgün bir çözelti oluşturmak için yaklaşık 30 dakika boyunca ultrasonik bir temizleyicide (40 kHz) sonikleştirin.
- Hassas uca zarar vermemek için önceden çekilmiş cam kılcal damarı çok dikkatli tutun. 10 μl'lik bir enjeksiyon şırıngasının somununu sökün ve kılcal damarın düz ucuna geçirin, ardından iki yüksük uygulayın, yüksüklerin eşleşen uçlarının hizalandığından ve kılcal damarın konik yüksüğe tam oturduğundan emin olun (Şekil 1). Şırıngayı izopropil alkolle durulayın ve pistonu çıkarın. Kuruduktan sonra, iğne tertibatını enjeksiyon şırıngasına elle sıkıca vidalayın.
- Metal göbek iğnesini astar şırıngasına takın. İğne ile lastik bir diski delin ve tabana doğru kaydırın. Astar şırıngasını lizolesitin ile doldurun. İğnenin ucunda sıvı görünene kadar astar şırıngasına hafifçe bastırın. Bu, enjekte eden şırıngaya hava kabarcıklarının girmemesini sağlar.
- Astar şırıngasının metal göbek iğnesini enjeksiyon şırıngasına yerleştirin. Kauçuk disk ile sıkı bir sızdırmazlık sağlayarak, kılcal damar ucu çözelti ile doldurana kadar astar şırıngasına yavaşça bastırın. Enjeksiyon şırıngasının namlusunu hava kabarcıkları oluşturmadan doldurmak için aynı anda bastırırken, astar şırıngasını dikkatlice çıkarın. Pistonu enjeksiyon şırıngasına yerleştirin ve pistona hafifçe bastırılırken çözeltinin kılcal damarın ucundan aktığından emin olun.
NOT: Kılcal veya enjeksiyon şırıngasında herhangi bir hava kabarcığı görünüyorsa, şırınga hazırlığı baştan tekrarlanmalıdır. Enjeksiyon aparatındaki sürekli sıvı, doğru enjeksiyon hacimlerini sağlamak için kritik öneme sahiptir.
- Tamamlanan enjeksiyon şırıngasını stereotaktik bir mikromanipülatörün koluna takın. Tamamlanan bu cihaz, yeniden doldurulmaya ihtiyaç duymadan önce 15-20 hayvana enjekte edebilecek.
- Kalan lizolesitini astar şırıngasından atın. İzopropil alkolü birkaç kez çekin ve bastırın ve metal göbek iğnesini çıkarın. Tekrar doldurmadan önce astar şırıngasında kalan izopropil alkolün buharlaşması için birkaç saat bekleyin.
2. Hayvanı Cerrahi İşleme Hazırlayın
NOT: Bu prosedür, 8-10 haftalık dişi C57BL/6 fareler için açıklanmıştır.
- Hayvanı intraperitoneal ketamin (200 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) enjeksiyonu ile veya kurumsal hayvan bakımı yönetmeliklerine göre uyuşturun. Enjekte edilebilir anestezi kullanılıyorsa, hayvanın yaklaşık 1 saat anestezi altında kalmasını planlayın.
- Ayağını sıkıca sıkıştırarak hayvanın derin bir şekilde uyuşturulduğunu test edin. Düzgün anestezi uygulanmış bir hayvan, çimdiklemeye cevap vermeyecektir.
- Makas kullanarak, hayvanın sırt tarafında, kulaklara yakın 2-3 cm2 bir alanı tıraş edin. Kulaklara zarar vermemeye dikkat edin.
- Bir gazlı bez üzerine uygulanan %70 etanol ile alanı silerek temizleyin. Kesilen tüm saçların bölgeden çıkarıldığından emin olun. Alanı iyot ile dezenfekte edin.
- İşlem boyunca kurumayı önlemek için gözlere vazelin sürün.
- Prosedüre başlamaya hazır olana kadar hayvanı ısıtılmış bir geri kazanım odasında tutun.
3. Cerrahi İşlemi Gerçekleştirin
NOT: Prosedürün tüm adımları için yeterli aseptik tekniği sağlayın. Buna eldivenlerin, saç ağlarının, maskelerin ve perdelerin uygun kullanımı dahildir. Hayvanla temas etmeden önce tüm aletler sterilize edilmelidir.
- Hayvanı, omurganın eğriliğini abartmak için katlanmış kağıt havlularla orta kısımda yükseltilmiş, sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaktik bir çerçeveye taşıyın. Kolları ve kuyruğu cerrahi bantla sabitleyin ve başı bir diş kelepçesi ile sabitleyin. Bu prosedür için sabitleyici kulak çubukları gerekli değildir.
- Kulakların hemen altından başlayıp kaudal yönde keserek 3 cm'lik bir orta hat kesisi yapmak için bir neşter kullanın.
- İki büyük yağ yapısı arasındaki ayrımı bulun ve bunları ayırmak için her iki elinizde ince forseps kullanın. Cerrahi alanı açmak için ekartörleri yayın.
- Cerrahi mikroskop altında, torasik vertebra 2 (T2) omurunun belirgin büyüme sürecini bulun (NOT: Bu özellik, C57BL/6 fare suşunun karakteristiğidir). T2'yi daha iyi görselleştirmek için üst üste binen kas sistemi boyunca kapalı yaylı makasla künt bir diseksiyon yapın. Forsepsleri kullanarak, uygun anatomik konumu doğrulamak için torasik vertebra 3 (T3) ve torasik vertebra 4'ün (T4) sert yüzeylerini hissedin.
- Yaylı makas kullanarak, T3 ve T4 arasındaki bağ dokusunun sığ yanal kesimlerini (2-3 mm derinliğinde) yapın. Fare vertebral kolonunun üst torasik kısmındaki omurlar arasındaki doğal boşluk nedeniyle, omuriliği ortaya çıkarmak için laminektomi gereksizdir. Çok derin bir kesiğin kabloyu deleceğini ve zarar vereceğini unutmayın.
NOT: Bu adımda küçük bir derecede kanama yaygındır. Böyle bir durumda, kanama azalana kadar (30-60 saniye) bölgeye bir sünger mızrak tutun.
- Omuriliği görselleştirin. Kordon açığa çıkarken bu meningeal tabaka henüz kesilmemişse, kalın bir görünür dura tabakası ile kaplanacaktır. Belirgin bir kan damarı, omuriliğin yaklaşık orta hattı boyunca kaudal / rostral boyunca uzanır.
NOT: Bu damar sistemi, orta hat için bir dönüm noktası olarak kullanılmamalıdır. Bunun yerine, yeterli aydınlatma, orta hattı tahmin etmek için kullanılması gereken sırt kolonu çevreleyen gri-beyaz madde sınırlarını ortaya çıkarmalıdır.
- Dura sağlam kalırsa, temizlenene kadar 32 G metal iğne ile hafif yanal sıyrıklar yapın. Amaç, o kadar kalın olmayan ve görülmesi daha zor olan altta yatan meninksleri kesmeden durayı çıkarmaktır.
NOT: Beyin omurilik sıvısının serbest bırakılması, araknoidin kırıldığını gösterir ve bu, dokuya mekanik hasar vermeden gerçekleşebilirken, kordun yüzeyini daha iyi görselleştirmek için biriken beyin omurilik sıvısı bir sünger mızrakla çıkarılmalıdır.
- Enjekte eden şırıngayı yerine hareket ettirin ve kılcal damarın ucu, orta hattın her iki tarafının hemen yanındaki omuriliğe zar zor değene kadar yavaşça indirin. Kolu yerine kilitleyin.
- Temel konum ölçümü yapmak için Z yönü stereotaktik kolun kademeli ölçümlerini kullanın. Bu okumadan 1,3 mm çıkarın. Dokuyu delmek için hızlı ve sığ bir aşağı doğru hareket kullanın ve yeni ölçüme ulaşılana kadar kılcal damarı dikkatlice indirin. İsteğe bağlı: İstenirse, dorsal kolondaki lezyonlar orta hatta aynı delici hareketle ve 0,3 mm derinlikte üretilebilir.
NOT: Bu değerler T3 ve T4 arasında enjekte etmeye özgüdür. Enjeksiyonu omuriliğin başka bir yerinde gerçekleştirmeyi tercih ediyorsanız, bu değerler mevcut herhangi bir fare beyin atlasından türetilmelidir.
- Lisolasitini ventral omurilik beyaz cevherine bastırmak için mikromanipülatörü kullanın. Mikromanipülatörün 2 dakika boyunca her 5 saniyede bir dönüşünü yapın, bu da 0,5 μl'lik bir nihai hacim elde edilmesini sağlar. Çözeltinin geri akışını önlemek için kılcal damarı 2 dakika daha yerinde bırakın ve ardından kılcal damarı dikkatlice çıkarın.
- Omurgayı kaplayan kas / yağ dokusuna tek bir dikiş atın. Cildi kapatmak için kesintisiz bir dikiş kullanın. Kesi bölgesine daha fazla iyot uygulayın.
- Hayvanı iyileşene kadar ısıtılmış bir geri kazanım odasına koyun, ardından kafesine geri koyun. Ameliyat sonrası kurumsal hayvan bakımı yönetmeliklerine uygun olarak analjezik uygulayın. Hayvanlar tamamen ayaktan olduklarından ve anesteziden kurtulur iyileşmez kendi kendilerini besleyip içebildiklerinden, ameliyat sonrası ek bakım genellikle gerekli değildir.
- Kalan hayvanlar için prosedürü tekrarlayın.
NOT: Ustalıkla, özellikle dikiş atan ikinci bir kişinin yardımıyla hayvan başına 10-15 dakikada operasyon tamamlanabilir. Aynı cam kılcal damar, uç künt hale gelmeden önce yaklaşık 15-20 ameliyat için kullanılabilir ve yerine konması gerekir. Kontrol ameliyatları, lizolesitin yerine omuriliğe PBS enjeksiyonu ile tarif edildiği gibi aynı şekilde yapılabilir. Kılcal damarların ileride kullanmak üzere temizlenmesini önermiyoruz.
