Bir Drosophila larvasında yüksek güçlü bir lazer kullanarak hedeflenen nöronal hasarın indüklenmesi

Özet

Kaynak: Li, D., Li, F., et al. Periferik ve merkezi sinir sisteminde nörorejenerasyonu incelemek için bir Drosophila in vivo yaralanma modeli. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, yüksek güçlü bir lazer kullanarak Drosophila larvalarında hedeflenen nöronal hasarı indüklemek için bir yöntemi göstermektedir. Larvaları mikroskop altında konumlandırdıktan sonra, düşük güçlü bir lazer floresan nöronları tarar ve daha sonra lokalize hasarı indüklemek için lazer gücü artırılır. Yaralanma, artan floresan ve yaralanma bölgesinde bir krater ile doğrulanır.

Protokol

1. İki Foton Yaralanması ve Konfokal Görüntüleme

1. Mikroskop kurulumu
   NOT: Bu deney için iki fotonlu lazerli bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılmıştır, ancak eşdeğer bir kuruluma sahip diğer sistemler de yeterli olacaktır. GFP'nin yaralanma sağlamak için iki fotonlu lazer (930 nm) ve konfokal görüntüleme için bir Argon lazer (488 nm) kullanıldı.
   1. Her seansın başında, iki fotonlu lazeri ve / veya konfokal lazerleri ve mikroskobu açın. Ardından, görüntüleme yazılımını açın.
   2. İki foton yaralanması için, 930 nm'de (1.950 mW) iki fotonlu lazerle GFP'yi görüntülemek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın.
      1. Çizgi tarama modunu seçin. İğne deliğini sonuna kadar açın. Lazer yoğunluğunu ~%20'ye (390 mW) yükseltin.
      2. Kare taraması olarak 512 x 512'yi seçin. Maksimum tarama hızı kullanın (tipik olarak piksel bekleme süresi 0,77 μs'de). Ortalama sayının 1 ve bit derinliğinin 8 bit olduğundan emin olun.
      3. Kazancı ~750 ve ofseti 0 olarak ayarlayın.
      4. Bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü 2P GFP 930 Ablation olarak kaydedin ve gelecekteki deneylerde kolay yeniden kullanıma izin verin.
   3. Konfokal görüntüleme için, GFP'yi Argon lazer ile 488 nm'de görüntülemek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın:
      1. Acquisition sekmesini ve ardından Z-stack öğesini seçin.
      2. "Laser" altında, 488 nm Argon lazerin gücünü açın.
      3. Kanallar'a gidin, 488 mm lazeri seçin ve lazer gücünü %5-10'a yükseltin. İğne deliği için 1-2 havadar üniteyi (AU) kullanın. Kazancı 650'ye ayarlayın.
      4. Edinme Modunda, çerçeve taraması olarak 1024 x 1024'ü seçin, maksimum tarama hızını, ortalama 2 sayısını ve 8 Bit bit derinliğini kullanın.
      5. Bu önceden ayarlanmış deneysel protokolü GFP(yeşil floresan protein) Görüntüleme olarak kaydedin.
2. Dietil eter ile larva anestezisi ve montajı
   1. Çeker ocakta, 15 cm'lik plastik bir Petri kabına 60 mm'lik bir cam tabak yerleştirin. Cam tabağın dibine bir parça kağıt mendil katlayın ve yerleştirin, ardından mendilin üzerine bir üzüm suyu agar tabağı yerleştirin. Cam tabağa, kağıt mendilin ıslandığı ve tabakta bir sıvı eter tabakası kaldığı noktaya kadar dietil eter ekleyin. Kapağı her zaman açık tutun.
   2. Ortasında bir damla halokarbon 27 yağı bulunan bir cam slayt hazırlayın. Daha sonra lamel desteklemek için sürgünün dört köşesine 4 nokta vakumlu gres ekleyin.
   3. Temizlenmiş bir larvayı almak için forseps kullanın ve 60 mm'lik cam tabaktaki agar plakasına yerleştirin. Cam tabağı kapağıyla örtün ve larva hareket etmeyi bırakana kadar bekleyin. PNS yaralanması/görüntülemesi için, kuyruğu seğirmeyi bırakır bırakmaz larvayı çıkarın. CNS için, tüm larva, özellikle baş bölümleri hareketsiz hale gelene kadar bekleyin.
      NOT: Eter maruziyetinin zamanlaması kritiktir. Tartışmaya bakın.
   4. Anestezi uygulanmış larvaları dikkatlice alın ve slayttaki halokarbon yağı damlasına baş dik olarak yerleştirin. Slaytın üstüne bir lamel ekleyin. Lameli larvaya değene kadar aşağı doğru itmek için hafif bir baskı uygulayın (Şekil 1A).
   5. Larvaları yuvarlamak için lameli hafifçe sola veya sağa doğru iterek larvanın konumunu ayarlayın, böylece ilgilenilen nöron/akson/dendrit üstte ve mikroskop merceğine en yakın olacaktır.
   6. PNS yaralanması için, her iki trakea da görünecek şekilde larva sırt tarafını yukarı monte edin. Daha sonra larvaları sınıf III da nöron aksonlarını yaralamak için ~30 derece sola (Şekil 1B ve 1C), sınıf IV da nöron aksonlarını yaralamak için 90 derece (Şekil 1B ve 1E) veya sınıf IV da nöron dendritlerini yaralamak için ~30 derece yuvarlayın.
   7. CNS yaralanması için, larvaları mükemmel bir şekilde ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın, böylece ilgilenilen bölge z düzlemindeki mikroskop merceğine en yakın olacaktır.
3. İki fotonlu lazerle yaralanma
   1. Larva ile slaytı mikroskop altına yerleştirin ve sahne üzerindeki slayt tutucu ile yerine sabitleyin. Larvayı bulmak için 10X (0.3 NA) hedefini kullanın.
   2. Lamel üzerine 1 damla objektif yağı ekleyin, 40X (1.3 NA) objektife geçin ve odağı ayarlayın.
   3. Tarama moduna geçin ve 2P GFP 930 Ablation deneysel protokolünü yeniden kullanın. İğne deliğinin tamamen açık olduğundan emin olun.
      NOT: Yapılandırmanın tek tek sistemlere göre optimize edilmesi gerekir.
   4. İlgilenilen bölgeyi (ROI) bulmak için Live modunu başlatın ve uygun yakınlaştırma ile iyi görüntü kalitesi elde etmek için ayarlarda ince ayar yapın.
      NOT: Bu adımın amacı, en kaliteli görüntüyü almaktan ziyade, yaralanacak nöron/akson/dendriti bulmaktır. Bu nedenle, aşırı pozlama veya foto ağartmayı önlemek için hedef alanı görselleştirmek için yeterli minimum ayarları kullanın.
   5. Live scan'ı durdurun, böylece Kırp düğmesi kullanılabilir hale gelir. Hareketsiz görüntünün yol haritası olarak hizmet etmesine izin verin. Kırp işlevini seçin ve tarama penceresini yaralanacak hedefe odaklanacak şekilde ayarlayın.
   6. Yatırım getirisini, olası yaralanma bölgesinin boyutu olacak şekilde azaltın. Örneğin, yaralanmanın hassasiyetini sağlamak ve komşu dokulara verilen zararı azaltmak için bir akson veya dendritin genişliğini kaplayın. İstenirse, kırpmadan önce yatırım getirisini yakınlaştırarak daha hassas yaralanmaya izin verin.
   7. Yeni bir görüntüleme penceresi açın. Tarama hızını azaltın ve lazer yoğunluğunu artırın. Canlı modunda taranan doku floresan sinyaline dayalı olarak lazer yoğunluğundaki artışı belirleyin.
   8. Tipik olarak, PNS yaralanması için% 25'ten ve VNC yaralanması için% 50-100'den başlayarak iki fotonlu lazer yoğunluğunu ayarlayın. PNS akson yaralanması için lazer yoğunluğunun ~480 mW ve piksel bekleme süresinin 8,19 μs olduğundan emin olun. VNC akson yaralanması için, lazer yoğunluğunun ve piksel bekleme süresinin sırasıyla 965-1930 mW ve 8.19-32.77 μs olduğundan emin olun.
   9. Sürekli scan'ı başlatın. İmleci Sürekli düğmesinin üzerine getirin. Görüntüyü yakından takip edin ve floresanda ciddi bir artış gözlenir gözlenmez taramayı durdurun.
      NOT: Floresan artışının görünümü, yaralanma bölgesindeki otomatik floresanstan kaynaklanmaktadır.
   10. Ayarları yeniden kullanarak Canlı moda geri dönün. Odağı ayarlayarak az önce hedeflenen ilgi alanını bulun.
       NOT: Başarılı yaralanmanın iyi bir göstergesi, yaralanma bölgesinde küçük bir krater, halka benzeri yapı veya lokalize enkazın ortaya çıkmasıdır.
   11. Bir sonraki nörona geçin ve tek bir hayvanda birden fazla nöronu yaralamak için Adım 1.3.5'ten itibaren tekrarlayın. Veya ilk yaralanma yetersizse, gücü kademeli olarak artırırken ve/veya tarama hızını azaltırken Adım 3.3.5'i tekrarlayın.
       NOT: Lazer gücünün çok yüksek olması durumunda, yaralanma sonrası canlı tarama görüntüsünde büyük bir hasarlı alan görünecektir. Çok fazla yaralanma larvaların ölümüne neden olabilir.
   12. Lameli dikkatlice çıkararak ve yaralı larvaları maya ezmesi ile yeni bir tabağa aktararak larvaları kurtarın. Forseps ile agar plakası üzerinde birkaç mağara hendek açın; Alternatif olarak, larvaların plakadan dışarı çıkma olasılığını azaltmak için tüm plakayı kullanmak yerine plakada bir agar adası yapın.
   13. Plakayı ıslak dokulu (%0,5 propiyonik asit çözeltisi ile ıslatılmış) 60 mm'lik bir Petri kabına koyun ve oda sıcaklığında veya 25°C'de kültürleyin.
       NOT: Larva, 25°C'ye kıyasla oda sıcaklığında (22°C) yaklaşık bir gün daha larva aşamasında kalacaktır.

Sonuçlar

Şekil 1: Periferdeki Da nöron akson rejenerasyonu sınıf özgüllüğü gösterir. (A ve B) Larvaların konumunu gösteren şematik çizim. (C) Sınıf III da nöronlarının şematik çizimi. (D) 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+ ile etiketlenmiş sınıf III da nöronları ddaF'nin aksonları yeniden büyüyemez. (E) Sınıf IV da nöronlarının şematik çizimi. (F) ppk-CD4-tdGFP/+ ile etiketlenmiş sınıf IV da nöronları ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dietil eter, ACS reaktifi, susuz	Acros Organik	AC615080010
Halokarbon 27 Yağı	Genesee Bilimsel	59-133
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 20x Konsantre, pH 7.5, tedarikçi # E703-1L	VWR	97062-948
Agar tozu, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Üzüm suyu	Welch'in
Etanol %95 (Reaktif Alkol %95)	VWR	64-17-5
Asetik asit	Sigma-Aldrich	A6283
Propiyonik Asit	J.T.Baker	U33007
Kapak Camları: Dikdörtgenler	Fisher Bilimsel	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 lazer tarama mikroskobu	Zeiss
Zen yazılımı	Zeiss
Bukalemun Ultra II	Tutarlı