1. Ortam ve Reaktiflerin Hazırlanması
- Kültür plakaları için bazal membran matris kaplamasını 4 °C'de çözün (bazal membran matrisinin ısınmasına izin vermeyin, aksi takdirde katılaşacaktır). 1 mL alikot yapın ve -20 °C veya -70 °C'de saklayın.
- Steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde bazik fibroblast büyüme faktörünü (bFGF) 10 μg / mL'de sulandırın ve 10 μL alikotlar yapın. 4 °C'de saklayın.
- Glutamin içeren yeni, açılmamış, 500 mL'lik bir DMEM / F12 şişesine B27 (10 mL), N2 (5 mL) ve penisilin-streptomisin (5 mL) ekleyin. Bu nöral kök hücre (NSC) ortamının 50 mL'sini konik bir tüpe yerleştirin ve 10 μL 10 μg/μL (2 μg/mL final) bFGF ekleyin. NSC (+) bFGF ortamını 4 °C'de saklayın.
- (-) bFGF ortamı yapmak için, adım 1.3'te açıklananla aynı tarifi kullanın, ancak bFGF eklemeyin. Bu besiyeri, NSC'leri nöronlara farklılaştırmak ve farklılaşmadan sonra nöronal kültürleri korumak için kullanılacaktır.
2. Lentiviral Yapılar
NOT: Lentiviral yapılarla çalışmaya başlamadan önce, laboratuvarın biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) ajanlarını kullanmak üzere onaylandığından emin olun. Ayrıca, lentiviral vektörlerle çalışırken BSL-2 kültür başlıkları, kişisel koruyucu ekipman (KKD) ve bertaraf yöntemleri kullanılmalıdır.
- Tercih edilen bir kaynaktan lentivirüse paketlenmiş tau yapılarını edinin.
3. İnsan Nöral Kök Hücrelerinin Kültürlenmesi
NOT: NSC'ler tipik olarak 100.000–150.000 hücre/cm2 olarak tohumlanır ve ticari olarak mevcut NSC'lerin çoğu 1 x 106 hücre/flakon olarak satılır. Bu protokol 10 cm'lik hücre kültürü kapları için optimize edilmiştir (ancak diğer boyutlarda kaplar da kullanılabilir); bu nedenle, ticari olarak mevcut NSC'ler kullanılıyorsa, NSC'lerin 10 cm'lik tabakları tohumlamak için yeterli hücre elde etmek için önce altı oyuklu tabaklarda kültürlenerek genişletilmesi gerekebilir. Bu protokol alternatif olarak çeşitli hücre kültürü çanağı boyutları için uyarlanabilir.
- Hücre kültürü plakalarının hazırlanması için, hücre kültürü plakaları için donmuş bazal membran matris kaplamasının bir alikotunu çıkarın ve 4 °C'de çözülmesine izin verin (alikotlar, hücrelerin tohumlanmasından bir gün önce gece boyunca 4 °C'de yerleştirilebilir). 5 mL DMEM/F12 ortamı + penisilin-streptomisin'e 385 μL bazal membran matris kaplaması ekleyin.
NOT: 5 mL DMEM/F12 ortamı + penisilin-streptomisin, 10 cm'lik tek bir tabağı kaplamak için yeterlidir (bu bazal membran matris kaplama solüsyonunun 1 mL'si, altı oyuklu bir tabağın bir kuyusunu kaplamak için yeterlidir). Alternatif olarak, hücreler sabitlenecek ve immün olarak boyanacaksa veya tioflavin için boyanacaksa, 24 oyuklu kültür kaplarında cam lameller üzerindeki kültür hücreleri.
- Ortamı ve matris kaplamayı kültür kaplarına eklemeden önce ve eklerken soğuk tutun. Bazal membran matris kaplamasını kültür kaplarına ekleyin ve bulaşıkları 1 saat boyunca bir inkübatöre (37 °C'de) yerleştirin. Optimum kaplama için, bazal membran matrisini 1 saatten fazla veya daha az inkübe etmeyin. 1 saat sonra, hücre kültürleri kaplarından bazal membran matris kaplamasını aspire edin. Bunun, NSC'lerin kaplanmaya hazır olmasıyla aynı zamana denk geldiğinden emin olun.
NOT: Hücreler donmuş stoklardan çözülmüyorsa, adım 3.2'yi atlayın ve adım 3.3 ile devam edin.
- Hücreler donmuş NSC stoklarından çözülüyorsa, bir şişe donmuş hücre alın ve şişeyi suda ileri geri hareket ettirerek 37 ° C'ye ısıtılmış bir su banyosunda ısıtın. Çözüldükten sonra, şişeye% 70 etanol püskürtün ve bir hücre kültürü başlığına yerleştirin. Hücreleri ~ 10 mL DMEM / F12 + penisilin-streptomisin ortamına aktarın ve tüpü oda sıcaklığında 1.000 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Medyayı aspire edin ve NSC medyasındaki hücreleri yeniden askıya alın.
- Kullanılmakta olan hücre kültürü kabı için uygun tohumlama yoğunluğunu elde etmek için hücreleri NSC ortamında seyreltin.
NOT: Örneğin, NSC'ler altı oyuklu bir plakaya kaplanıyorsa - altı oyuklu bir kültür kabındaki bir kuyucuk 9 cm2} yüzey alanına sahiptir - tohumlamak için 900.000 ila 1.350.000 hücre gerekir. Bu nedenle, 1.000.000 hücre içeren bir şişe, 2 mL ortamda yeniden süspanse edilebilir ve altı oyuklu bir tabağın tek bir kuyucuğuna eklenebilir.
- Bazal membran matris kaplı kültür kaplarını (100.000 hücre/cm2) tohumlamak için NSC ortamında asılı kalan yeterli sayıda hücre ekleyin ve ortamı iki günde bir değiştirin (donmuş bir stok kullanıyorsanız, ortamı kaplamadan sonraki gün ve daha sonra her gün değiştirin). Hücreleri %75-80 birleşene kadar büyütün.
NOT: Hücreler, kaplamadan kısa bir süre sonra muhtemelen %75-80 birleşmeye ulaşacaktır, ancak donmuş stoklar kullanılırsa bu daha uzun sürebilir.
- NSC'ler %75-80 oranında birleştiğinde, NSC (+) bFGF ortamını çıkararak ve onu NSC (-) bFGF ortamı ile değiştirerek nöronal farklılaşmaya başlayın. Bu ortamdaki hücreleri en az 4 hafta boyunca kültürleyin (ortamı her gün değiştirin).
NOT: Hücreler, bFGF'nin çekilmesini takiben birkaç gün boyunca bölünmeye devam edecektir; bu nedenle, hücreler% 90-100 birleşmeye ulaşabilir.
- 4 hafta boyunca kültürlendikten sonra, hücreler nöronal bir kadere ulaşmış olacak ve lentivirüs tedavisi için hazır olacaktır.
4. Nöronal Kültürlerin İletimi ve Bakımı
- Lentivirus ile nöronları dönüştürmek için, 3.4 x 105 dönüştürülebilir birim/hücre titre sayısı kullanın (%100 birleşik 10 cm'lik bir tabak ~ 10 milyon nöron içerecektir). Aktarılabilir birimleri hücre kültürü ortamında gerekli konsantrasyona seyreltin ve bunları hücrelere ekleyin (hücre kültürü kabı için normal ortam hacmini kullanın). Lentivirüsü ekledikten iki gün sonra, hücreleri 1x taze (-) bFGF besiyeri (lentivirüs olmadan) yıkayın ve her zamanki gibi (-) bFGF besiyerinde kültürlemeye devam edin.
- Post-lentiviral tedavi için, hücre kültürü ortamını ([-] bFGF ortamı) her gün değiştirerek dönüştürülen nöronları besleyin. Hücreleri transdüksiyondan sonra ~ 8 hafta boyunca koruyun. Canlılığı sağlamak için hücreleri rutin olarak ışık mikroskobu altında görselleştirin.
NOT: Seyreklik veya dendritik kırılmalar, hücrelerin artık canlı olmadığının işaretleridir.
