Nöronlarda Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Ölçülmesi

Abstract

Kaynak: Liang, K. X., et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde ve Nöral ve Glial Türevlerinde Çoklu Mitokondriyal Parametrelerin Akış Sitometrik Analizi. J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, nöronal hücrelerin mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri, mitokondriyal DNA ile ilişkili protein ve mitokondriyal dış zar proteini için antikorlarla etiketlenmesini ve ardından seviyelerini ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir.

Protocol

1. Sabit hücrelerde MRC (mitokondriyal solunum zinciri) kompleks alt birimlerinin ve TFAM'ın (mitokondriyal transkripsiyon faktörü A) akış sitometrisi ölçümü

1. Kültür periyodunun sonunda, hücre ayrışma reaktifini ekleyerek hücreleri (~ 10 ⁶ ) ayırın; daha sonra hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve toplayın. Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) (1x) ile santrifüjleyerek 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyerek iki kez yıkayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca% 1.6 paraformaldehit (PFA) (15 mL'lik bir tüpte 1.6 mL% PFA) içinde sabitleyin. Hücreleri PBS (1x) ile santrifüjleyerek 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyerek iki kez yıkayın.
3. Hücreleri buz gibi %90 metanol (15 mL'lik bir tüpte 1 mL %90 metanol) ile -20 °C'de 20 dakika boyunca geçirgen hale getirin.
4. Numuneleri 0.3 M glisin,% 5 keçi serumu ve% 1 sığır serum albümini (BSA) - PBS'de (1x) Fraksiyon V (15 mL'lik bir tüpte 1 mL bloke edici tampon) içeren bloke edici tamponda bloke edin. Hücreleri PBS (1x) ile iki kez santrifüj ederek yıkayın.
5. Hücreleri aşağıdaki birincil antikorlarla 30 dakika boyunca inkübe edin: kompleks I alt biriminin ölçümü için anti-NDUFB10 (1: 1.000), kompleks II alt biriminin ölçümü için anti-süksinat dehidrojenaz kompleksi flavoprotein alt birimi A (SDHA, 1: 1.000) ve kompleks IV alt biriminin ölçümü için anti-COX IV (1: 1.000) ve Alexa Fluor 488 (1: 400) ile konjuge anti-TFAM (mitokondriyal transkripsiyon faktörü A) antikoru. Alexa Fluor 488 (1:400) ile konjuge edilmiş anti-TOMM20 (dış mitokondriyal membran 20'nin translokazı) antikoru ile 30 dakika boyunca aynı sayıda hücreyi ayrı ayrı boyayın (15 mL'lik bir tüpte 1 mL birincil antikor çözeltisi; antikorlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna ) bakın).
6. Hücreleri PBS (1x) ile bir kez santrifüjleme ile 300 × g sıcaklıkta 5 dakika boyunca yıkayın. NDUFB10, SDHA ve COX IV tüplerine ikincil antikor (1:400) ekleyin ve hücreleri bu solüsyonlarla 30 dakika inkübe edin.
7. Hücreleri 300 × g sıcaklıkta 5 dakika santrifüjleyerek PBS (1x) ile bir kez yıkayın. Tüplerde yaklaşık 100 μL bırakarak süpernatanları aspire edin. Hücre peletlerini 300 μL PBS'de (1x) yeniden süspanse edin. Hücreleri buz üzerinde karanlıkta tutulan 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
8. Akış sitometresindeki hücreleri analiz edin (3 mavi ve 1 kırmızı lazer konfigürasyonu ile). 1/1 bant geçiren filtre kullanarak filtre 530'deki (FL30) sinyalleri algılayın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TFAM	Abcam	ab198308	Primer Antikor; 1000 μL boyama çözeltisinde 1:400, 2.5 μL olarak kullanın; izotip kontrolü olarak fare monoklonal IgG2b Alexa Fluor® 488 kullanın.
anti-TOMM20	Santa Cruz Biyoteknoloji	Kedi# sc-17764 RRID:AB_628381	Primer Antikor; 1000 μL boyama çözeltisinde 1:400, 2.5 μL olarak kullanın; izotip kontrolü olarak fare monoklonal IgG2a Alexa Fluor® 488 kullanın.
NDUFB10 karşıtı	Abcam	ab196019	Primer Antikor; 1000 μL boyama çözeltisinde 1:1000, 1 μL olarak kullanın; ikincil antikor olarak Alexa Fluor ® 488 keçi tavşan önleyici IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) kullanın; izotip kontrolü olarak tavşan monoklonal IgG kullanın.
SDHA karşıtı	Abcam	ab137040	Primer Antikor; 1000 μL boyama çözeltisinde 1:1000, 1 μL olarak kullanın; ikincil antikor olarak Alexa Fluor ® 488 keçi tavşan önleyici IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) kullanın; izotip kontrolü olarak tavşan monoklonal IgG kullanın.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primer Antikor; 1000 μL boyama çözeltisinde 1:1000, 1 μL olarak kullanın; ikincil antikor olarak Alexa Fluor ® 488 keçi anti-fare IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) kullanın; izotip kontrolü olarak fare monoklonal IgG'yi kullanın.
PBS 1x	Thermo Fisher Bilimsel	18912014	Yıkama adımları için kullanılır
Formaldehit (PFA) %16	Thermo Fisher Bilimsel	28908	Hücre fiksasyonu
Glisin	Sigma-Aldrich	G8898	Arabelleği engellemek için kullanılır
Sığır Serum Albümini	Avrupa Biyoürünleri	EQBAH62-1000	İmmün boyama testlerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bloke edici ajan ve CDM bileşeni