Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. APP-C99 ( amiloid öncü proteini - C-terminal 99-amino asit fragmanının γ-sekretaz bölünmesine karşılık gelen Lusiferaz Raportör Sinyallerinin Ölçümü )
NOT: CG (C99-Gal4) hücrelerinin oluşumunun ayrıntılı açıklamaları için lütfen önceki yayınlara bakın.
- CG hücrelerini (20.000 hücre/kuyu) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) artı %10 fetal sığır serumu (FBS), 5 μg/mL blasticidin, 250 μg/mL antibiyotik ( örneğin , zeosin), ve 200 μg / mL higromisin B.
- Bir hemositometre ile hücreleri sayın.
- Mikroplakaları nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöre aktarın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
- Her oyuktan 100 μL büyüme ortamını çıkarın.
- % 0.2 dimetil sülfoksit (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N- (3,5-diflorofenasetil-L-alanil)] -S-fenilglisin t-bütilester (DAPT) veya diğer ilgili ErbB1 / ErbB2 inhibitörleri.
- İşlem görmüş CG hücrelerini mikroplakalarda 37 °C'de 24 saat inkübe edin.
- Mikroplakalardan 150 μL/kuyu büyüme ortamını çıkarın.
- 50 μL/kuyucuk lusiferaz tahlil reaktifi ekleyin (lütfen Malzeme Tablosu'na bakın).
- Mikroplakaları bir lüminesans mikroplaka okuyucusuna aktarın.
- Mikroplakaları hafif çalkalama ile 5 dakika oda sıcaklığında tutun.
- Lüminesans mikroplaka okuyucusunda saklanan önceden tanımlanmış bir programı kullanarak Firefly lusiferaz (FL) ile yayılan lüminesansı belirleyin.
