Fare Beyin Kesitlerinde Locus Coeruleus Bölgesini Tanımlamak için İmmünohistokimya

Özet

Kaynak: Schmidt, K. et al., Locus coeruleus'un fare beynindeki lokalizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu protokol, fare beyin bölümlerindeki locus coeruleus bölgelerini tanımlamak için immünohistokimyanın kullanımını ana hatlarıyla belirtir. Dopamin β-hidroksilazı yeşil florofor işaretli antikorlarla hedefleyerek, norepinefrin üreten nöronlar mikroskop altında yeşil floresan olarak görselleştirilir.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Beyin Dilimleme

1. % 3 izofluran uygulamasıyla fareleri hareketsiz hale getirmek ve uyuşturmak için.
   1. Bir pamuğu izofluran damlalarıyla ıslatın ve 15 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Hayvanın burnunu tüpe yerleştirin ve izofluranı solumasına izin verin. Ayak parmağını sıkıştırmaya yanıt vermeme nedeniyle anestezi derinliğini kontrol edin.
2. Hayvanı sırt üstü yatırın ve karnına erişirken ekstremitelerini bir T iğnesi ile sabitleyerek hareketsiz hale getirin.
3. Hayvanı cerrahi makasla kesin, karın derisini kesin ve göğüs bölgesindeki cildi kesin. T pimlerini kullanarak cildi sabitleyin. Daha sonra periton zarını göğüs kafesine kadar kırın. Göğüs boşluğunu kırarak ve diyaframı keserek kalbi açığa çıkarın.
4. Kanın hayvandan dışarı akmasına izin vermek için sağ atriyumu kesin. Sol ventriküle 25 gauge iğneli 10 mL'lik bir şırınga yerleştirin ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile perfüze edin.
   NOT: Bu, çözeltinin sistemik dolaşımdan akmasına ve sağ atriyumdan çıkmasına izin verir.
5. 10 mL'lik şırıngayı çıkarın ve 60 mL'lik şırıngaya bağlı 25 gauge bir iğne yerleştirin. 50 mL buz gibi %4 paraformaldehit (PFA) ile sol ventrikülden perfüz.
   1. %10 PFA çözeltisini H₂O içinde seyrelterek ve son %4 PFA çözeltisini 4 °C'de soğutarak buz gibi soğuk %4 PFA çözeltisi hazırlayın.
6. Farenin kafasını izole edin ve beyni kafatasından çıkarın.
   1. Cildi boyundan kesin ve ardından kafatasını ortaya çıkarmak için gözlere doğru kesin. Kafatasını boyundan buruna ve sonra bir göz küresinden diğerine kırın. Kafatasını soyun ve tüm beyni çıkarın.
7. Beyni 4 °C'de 24 saat boyunca %4 PFA'da inkübe edin.
8. Beyni forseps ile 25 mL% 30 sükroz çözeltisi ile doldurulmuş 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Beyin tüpün dibine çökene kadar 48-72 saat boyunca 4 ° C'de tutun.
9. Beyni, orta beyinden (bregmanın ~ 3 mm arkasında) koronal olan yetişkin bir fare beyin dilimleyici matrisi ile kesin. Beyin sapını içeren beyin bölümünü saklayın.
   NOT: Bu, biri korteksin çoğunu (kesiğin önü) ve diğeri beyin sapı/beyinciği (kesiğin arkası) içeren iki beyin bölümüyle sonuçlanacaktır. Aşağıdaki adımlar için beyin sapı bölümünü kullanın.
10. Beyin sapı bölümünü, optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile çevrili bir gömme kalıbının altına yerleştirilmiş kesilmiş yüzey ile gömün; gömülü beyni -80 °C'lik bir dondurucuya taşıyın ve daha fazla kullanılana kadar en az 12 saat dondurun.
11. Kriyostatta kesme: beyni OCT'de içeren gömme kalıbını kriyostatın içine yerleştirin; Beyin bloğunun sıcaklığını kriyostatın sıcaklığına göre ayarlamak için kriyostatta birkaç saat inkübe edin.
12. Beyni içeren OCT bloğunu ortaya çıkarmak için gömme kalıbını soyun.
13. Beyne dokunmadan bloğun yüzeyindeki fazla OCT'yi çıkarmak için tıraş bıçağı kullanın.
14. OCT bloğunu kriyostatın aynasına monte edin ve beynin kesik yüzeyini öne doğru açığa çıkarın.
15. Beynin kesilen yüzeyini, kriyostatın tıraş bıçaklarına paralel olarak yönlendirilecek şekilde ayarlayın.
16. Medulladan başlayarak beyni kesin, rostral olarak 100 μm'lik bölümler kesin.
17. Beyincik ve beyin sapı sürekli bir dilim olarak kesilene kadar rostral olarak kesin. 50 μm kalınlığında dilimleri toplamaya başlayın.
    NOT: Medulladan rostral olarak budanırken, beyin sapı ve beyincik iki ayrı bölüm olarak kesilecektir. Rostral bölümlerde, beyin sapı ve beyincik sonunda 4. ventrikül seviyesinde birleşecektir. 4. ventrikülün yan kenarları iyi bir şekilde oluştuğunda, beyincik ve beyin sapı tek bir sürekli dilim olarak çıkacaktır.
    1. Forseps ile OCT ile çevrili bir beyin dilimi toplayın ve PBS ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin (Şekil 1a). Locus coeruleus (LC), beyincik ve inferior colliculus bregmanın ~-5.52 mm posteriorunda buluştuğunda en belirgin olacaktır (Şekil 2b).
       NOT: LC'nin en ön kısmı, beyincik tamamen kesildiğinde ve artık bregmanın ~-5.34 mm posteriorunda inferior kollikulusu çevrelemeyecektir (Şekil 2c).

2. Dopamin β-Hidroksilaz (DBH) veya tirozin hidroksilaz (TH) için immünohistokimya (Şekil 1)

1. 1. Gün
   1. Seçilen dilimleri PBS'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   2. 4 ° C'de% 0.5 fosfat tamponlu tuzlu su içinde deterjan (PBSD) içinde 24 saat geçirgenleştirin.
      1. 125 μL deterjanı 25 mL PBS ile seyreltin.
2. 2. Gün
   1. Dilimleri %0,5 PBSD'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   2. Birincil antikor, anti-DBH veya anti-TH, 4 ° C'de% 0.5 PBSD'de 1:500'lük bir seyreltmede 18 saat boyunca ekleyin.
3. 3. Gün
   1. Dilimleri %0,5 PBSD'de 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   2. 16 saat boyunca% 0.5 PBSD'de 1:1000'lik bir seyreltmede istenen ikincil antikoru (yeşil floresan için 488 eşek anti-tavşan) ekleyin.
   3. 24 oyuklu plakayı alüminyuma sarın ve 4 °C'ye yerleştirin.
   4. Dilimleri %0,5 PBSD'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   5. PBS'de 5 dakika yıkayın.
   6. Dilimleri bir kalem fırçası ile bir su kabına aktarın.
   7. Suda yüzen dilimleri yüklü slaytlara monte edin.
   8. Sert ayarlı montaj medyasına sahip lamel bölümleri Dopamin beta-hidroksilaz
   9. Monte edilmiş beyin bölümlerini oda sıcaklığında 30 dakika kurutun.
   10. Uygun ikincil antikor florofor dalga boyundan gelen sinyalleri tespit etmek için ayarlarla konfokal veya floresan mikroskopta beyin dilimlerini görüntüleyin.
   11. Mikroskobu beyin diliminin odak düzlemine ayarlayın ve 10X büyütmede tek bir görüntü çekin.

Sonuçlar

Şekil 1: DBH veya TH için beyin dilimlerinin immün boyama ile LC tespiti. (a) Bir fare beyni, beyin sapı etrafında 50 μm'lik dilimlere ayrıldı ve iki adet 24 oyuklu tabakta toplandı. Toplanan her 5 ila 8. beyin dilimi, XFM ile görüntüleme için film kaplı lamel üzerine monte edildi. Bu dilimler kuyucuklar arasında mavi numaralarla etiketlenir. PBS'de yüzen bitişik dilimler, DBH'nin LC'yi tespit etmes...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Yetişkin fare beyin dilimleyici matrisi	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Anti-tavşan ikincil antikoru, Alexa Fluor 488 (kaynak - eşek)	Thermo Fisher Bilimsel	A-21206
Şarjlı cam slaytlar	Genesee	29-107
Konfokal mikroskop	Zeiss	LSM 800
Kriyostat	Microm GmbH	HM 505E
Kriyostat kesme bıçakları	Thermo Fisher Bilimsel	MX35
Makas Mini, 9.5cm	Antech Teşhis	503241
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol)	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Dopamin β-hidroksilaz (DBH) antikoru - kurum içi üretim (kaynak - tavşan)	B. Eipper	-
Dopamin β-hidroksilaz (DBH) antikoru - ticari olarak kullanılabilir (kaynak - tavşan)	Hücre Sinyali	8586
Şahin tüpleri, 50ml	ABD Bilimsel	339652
Foran (izofloran)	Baxter	NDC 1019-360-60
Forseps Mikro Adson	Antech Diagnostcs	501245
Sabit montaj ortamı	EM bilimleri	17984-24
Mikroskop	Pascal	LSM 5
Çok kuyulu plakalar, 24 kuyu	Thermo Fisher Bilimsel	930186
Optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT)	VWR/ doku teknolojisi	102094-106
Paraformaldehit (PFA)/ formalin %10	Fisher Bilimsel	SF98-4
Peel-A-Way tek kullanımlık gömme kalıpları	Polysciences Inc.	18646A
Kalem fırçası
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)	Yaşam Teknolojisi	14190250
Jiletler	Amazon	ASIN: B000CMFJZ2
Spatulalar	Antech Diagnostcs	14374
T pinleri	Ofis Deposu	344615
Stereotaksik Koordinatlarda Fare Beyni, Paxinos ve Franklin, 3. Baskı	Amazon	ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (PBSD hazırlamak için)	Sigma-Aldrich	T8787
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
Tirozin hidroksilaz (TH) antikoru (kaynak - tavşan)	EMD Millipore	AB152
Geniş alan floresan mikroskobu	Zeiss	Axio Zoom.V16