Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Lentivirus Hazırlığı (İsteğe Bağlı Adım)
- 10 ml DMEM /% 10 FBS varlığında yapılacak her lentivirüs için 10 cm'lik üç adet HEK293T hücresi plakasını bölün ve ~% 60-70 birleşmeye kadar büyütün. Hücreleri 37 °C'de %5 CO2 ile bir inkübatörde büyütün.
- Herhangi bir transfeksiyon reaktifi kullanarak aşağıdaki DNA plazmitlerini (toplam 10 μg) her bir plakaya transfekte edin: 6.4 μg CAG-Flex-GFP lentiviral vektör, 1.2 μg pMD2.G (VSV-g'yi kodlar), 1.2 μg pRSV-Rev ve 1.2 μg pMDLg/pRRE. Üç lentiviral ambalaj vektörü ticari olarak temin edilebilir.
Not: Bu yaklaşım 3. nesil lentiviral vektörleri kullanır, ancak 2. nesil vektörler ve ilişkili plazmitler de işe yarayacaktır.
- Lentivirüs ile temas eden veya lentivirüs içeren herhangi bir çözeltiyi veya cihazı etkisiz hale getirmek için BSL10 sertifikalı bir başlık içinde %2 çamaşır suyu çözeltisi içeren bir atık kabı hazırlayın. Daha sonra, ağartma çözeltisine transfeksiyondan 4-6 saat sonra ortamı tamamen çıkarın, aynı hacimde yeni ortamla değiştirin ve hücrelerin büyümesine izin verin.
- 4 gün sonra, ortamı 50 ml'lik konik tüplere toplayın ve herhangi bir hücre kalıntısını peletlemek için 15 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı 0.45 μm'lik bir zardan süzün. PVDF gibi herhangi bir düşük protein bağlayıcı filtre iyi çalışır. Dikkat: Hem katı hem de sıvı viral atıkları ağartma solüsyonuna yerleştirin.
- 30 ml filtrelenmiş süpernatanı ultrasantrifüj tüplerine ve bir ultrasantrifüje yükleyin. 4 ° C'de 2,5 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin. Santrifüj tüplerini bir BSL2 davlumbazında açın ve süpernatanı% 10 Çamaşır Suyuna çıkarın. Pelete ~ 100 μl PBS ekleyin, bu da 1x10 ila 1x108 enfeksiyöz birim/ml titreleri verir. Ertesi gün alikot edin ve -80 ºC'de saklayın. Lentivirus alikotları en az altı ay boyunca -80 ° C'de stabildir.
- Önemli husus: Artık birçok kurumun viral çekirdekleri var. En iyi sonuçlar için minimum 1x107 enfeksiyöz birim/ml titresi ile konsantre virüs elde edin.
2. MGE Diseksiyonu için Donör Fareler
- İlk olarak, Cre ifade eden bir ilgi hattı ile vahşi tip (WT) bir fare veya Cre aracılı rekombinasyondan sonra bir muhabiri ifade edecek bir fare arasında zamanlanmış bir eşleşme ayarlayın.
Not: Birçok Cre-driver hattı transgeniktir ve hemizigot durumda korunur ve yetiştirilir. Bu nedenle, embriyoların sadece yarısı Cre transgenini içerecektir. Cre alelini tespit etmek için kısa bir PCR için embriyolardan DNA hızlı bir şekilde hazırlanabilir. Cre+ embriyoları daha sonra sadece istenen genotipin MGE dokusu kullanılacak şekilde hasat edilebilir. Alternatif olarak, MGE diseksiyonu ve transplantasyonu için embriyoları seçmek için Cre'ye bağımlı bir raportör kullanılabilir.
- Hangi günün E13.5'e karşılık geleceğini hesaplayın. Hayvanlar bir önceki akşam eşleştirildiyse, fişin günü 0,5'tir. Donör dokusunun E13.5 olacağı gün doğum sonrası (P) 1 farelere sahip olmak için zamanlanmış hamile fareler veya P1 yavruları olan bir WT dişi sipariş edin. Alternatif olarak, donör hayvanları eşleştirmeden bir hafta önce bu çiftleşmeleri evde kurun.
Not: Aynı gün için hem E13.5 hem de P1 embriyoları/yavruları üretmeye yönelik eski stratejinin güvenilir bir şekilde yapılması genellikle zordur.
3. Ortam, araç ve gereçlerin hazırlanması.
- MGE hücre hazırlığı için reaktifleri ve araçları hazırlayın (Tablo 1).
- Temiz bir yüzey hazırlayın ve yüzeye temiz forseps, makas ve mikrocerrahi bıçak veya ince forseps (hassas doku diseksiyonu için) yerleştirin.
- Diseksiyon için Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) ve transdüksiyon için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbeco'nun modifiye kartal ortamını (DMEM) hazırlayın.
- 20-30 ml DMEM/%10 FBS'yi 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatöründe yaklaşık 1 saat önceden inkübe edin. Ortamın gaz değişimine ve pH dengesine izin vermek için kapak gevşetilmelidir.
Not: Besiyeri ön inkübasyonu, diseksiyona başlamadan hemen önce hazırlanabilir.
4. MGE Hücre Hazırlığı
- Hamile fareyi onaylanmış bir hayvan protokolüne göre sakrifiye edin ve embriyoları buz gibi HBSS içeren 10 cm'lik bir petri kabına alın.
- Bir diseksiyon kapsamı kullanarak beyni her embriyodan çıkarın (her seferinde bir tane yapın, embriyoların geri kalanını buz gibi soğuk HBSS'de bırakın) ve ardından MGE dokusunu kesmeye devam edin.
Not: Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan ve Şekil 1, MGE'nin nasıl kaldırılacağını gösteren temel adımlardır.
- Beyni ventral tarafı yukarı bakacak şekilde konumlandırın (Şekil 1A, A'). Not: sırt yönünün yukarı bakması da sorun değil. İki parça oluşturmak için beyni sagital düzlem boyunca ikiye bölün. Örnek bir hemisekte beyin gösterilmiştir (Şekil 1B, B'); Beynin dorsal (üstteki korteks) ve ventral yönlerinin ganglionik üstünlük (GE) dokusunu kapladığını ve çevrelediğini fark edin.
- Daha sonra, baskın bir el ile, baskın olmayan bir el tarafından tutulan forsepslerle yarım küreyi hareketsiz hale getirirken ya çok ince forseps ya da bir bıçak bıçağı (Tablo 1) tutun. (Yarım kürenin medial yönü yukarı bakmalıdır). Altta yatan GE dokusunu ortaya çıkarmak için sırt ve ventral dokuyu forseps ve bir bıçak bıçağıyla açın (Şekil 1C ve Şekil 1C').
Not: Diseksiyon petri kabından bazı ortamların çıkarılması, MGE diseksiyonu yapılırken dokuyu stabilize etmeyi kolaylaştırabilir.
- CGE, LGE ve septal dokuları ayırmak için bıçak bıçağı veya ince forseps ile düz kesimler yapın (kırmızı kesikli çizgilerle gösterilen örnek kesimlere bakın, Şekil 1D ve D'). Bu kesimler herhangi bir sırayla yapılabilir.
Not: MGE'yi çevreleyen dokudan kesilmiş bir 'kutu' olarak hayal edin. Bunu yapmak, her diseksiyon için tekrarlanabilir şekilde benzer kesimler yapılmasına yardımcı olur, böylece doku diseksiyonlarındaki değişkenliği azaltır.
- Son olarak, MGE'yi yan çevirin ve altını kesin (beynin yanal yönü neydi). Bu, MGE'nin manto bölgesini (Şekil 1E ve 1E') MGE'nin geri kalanından kaldırır. MGE'nin geri kalan yönü, esas olarak, neredeyse tüm MGE progenitör hücrelerini içeren MGE'nin ventriküler zon ve subventriküler zon kısımlarını içerir. Bu doku ile devam edin.
- Önemli husus: Bir petri kabının dibine silikon jel eklenmesi, forsepslerin hassas uçlarını koruduğu ve dokuyu forseps ile sabitlemek için yumuşak bir yüzey sağladığı için mükemmel bir diseksiyon yüzeyi görevi görebilir.
5. Lentiviral Etiketleme ve Transplantasyon
- MGE doku tüplerini BSL2 sertifikalı bir başlığa taşıyın ve ortamı çıkarın.
Not: MGE dokusu görülebilecek kadar büyüktür ve tüpün dibine yerleşerek soğuk ortamın kolayca ve nazikçe çıkarılmasını sağlar.
- 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatöründe önceden inkübe edilmiş ~ 500 μl DMEM /% 10 FBS ortamı ekleyin. Daha sonra, 8 μg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda her tüpe transdüksiyonu kolaylaştırmak için polibren ekleyin. Bir P1000 pipet ucu kullanarak tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için MGE dokusunu ezin. Son olarak, her tüpe ~ 15-20 μl konsantre lentivirüs ekleyin.
- Önemli husus: Tek bir embriyodan MGE dokusunu ayırmak için 10-12 kez tritürasyon yeterlidir, ancak birden fazla MGE bir araya getirilirse daha fazla tritürasyon gerekebilir. Neyin en iyi sonucu verdiğini belirlemek için farklı ezme koşullarını deneyin.
- Her tüpü güvenli bir şekilde kapatın, karıştırmak için ters çevirin, ardından tüm tüpleri 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Hücreleri lentivirüste en az 30 dakika ve 1 saate kadar inkübe edin, daha uzun süreler hücre canlılığının azalmasına neden olmuştur. Süre dolana kadar tüpleri her 10 dakikada bir ters çevirin.
- Lentivirüs ile inkübe edildikten sonra, tüpleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri peletlemek için 3 dakika boyunca ~ 700 x g'da santrifüjleyin. BSL2 davlumbazında, süpernatanı çıkarın ve% 10 ağartıcıya atın. Daha sonra, 1 ml DMEM /% 10 FBS ekleyin ve peleti yıkamak için 2-3 kez ezin, ardından hücreleri peletlemek için aynı hızda tekrar santrifüjleyin. Fazla virüsü temizlemek için bu yıkama adımını 2-3 kez daha tekrarlayın.
Not: Santrifüj adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin; bununla birlikte, RT'de kısa dönüşler gerçekleştirildiğinde azalmış canlılık gözlenmemiştir.
- Son yıkamadan sonra, mümkün olduğu kadar çok ortamı çıkarın ve her tüpü buzun üzerine koyun. Tüpün yanlarındaki kalıntı ortam nedeniyle, transplantasyon prosedürü başladığında ~ 2-3 μl ortam hücre peletini kaplayacak şekilde sona erecektir.
6. Transplantasyon ve Validasyon
- Konakçı P1 yavrularını edinin ve %70 etanol püskürterek işlem alanını hazırlayın. Prosedür sırasında steriliteyi korumak için bu prosedürlerin özel bir temiz prosedür odasında yapılması önerilir. Ek olarak, otoklavlanmış cerrahi aletler kullanın ve yavruların temas edeceği yüzeyleri %70 etanol kullanarak sterilize edin. Transplantasyonları gerçekleştirmek için gereken temsili ekipmana bir örnek ve temsili bir prosedür alanı Şekil 2'de gösterilmiştir.
Not: Bu prosedür küçük hacimli bir enjeksiyon olsa da ve kesi, açık yara veya dikiş gerektiren cerrahi bir prosedür olmasa da, enjekte edilecek her fare için yeni bir mikropipet kullanılması önerilir. Mikropipetler, %70 etanol püskürtülmüş bir yüzeye çekilip eğim verildiğinde ısıyla sterilize edilir ve kapalı bir kapta saklanır.
- Ucunda 40-80 μm arasında bir çapa sahip olacak şekilde mikropipetler oluşturun. Bu boyutları takip etmek en iyi sonuçları verecektir. Mikropipetleri bir yüzeye çekildiğinde ve eğim verildiğinde ısıyla sterilize edin ve mikropipetleri kapalı bir kapta saklamadan önce %70 etanol püskürtün.
Not: Alternatif olarak, bu iğneleri oluşturmak için gereken cihazlara erişim (Tablo 1) sınırlanıyorsa, başka bir enjeksiyon cihazı kullanın. Ancak bunlar, farklı çaplar nedeniyle mikropipetler kadar uygun olmayabilir.
- Mineral yağı 1 ml'lik bir şırıngaya çekin ve 30 1/2 G'lik bir iğne ile cam pipeti tamamen mineral yağ ile doldurun. Ardından, pistonu stereotaksik cihaza monte edin, ardından cam pipeti stereotaksik cihaza takın ve pistona yükleyin. Hidrolik tahriki kullanarak, pistonu cam pipetin yaklaşık yarısına kadar hareket ettirin ve dökülen mineral yağı temiz bir kağıt havluyla temizleyin.
- Şırınga kullanmaya alternatif olarak, pipetin arka ucunu mineral yağa batırın ve kılcal hareketle doldurun. Pipette hava kabarcıklarını önlemek için, cam pipetten tamamen çıkana kadar şırınga üzerinde pozitif basınç uygulayın.
Not: MGE hücrelerini başarılı bir şekilde nakletmek için başka cihazlar da kullanılabilir. 100 nl'den daha az veya 100 nl'ye yakın bir hacim sağlayabilen herhangi bir cihaz bu prosedür için iyi çalışır.
- Ardından, MGE hücre peletinin üzerindeki fazla ortamı hassas bir şekilde çıkarmak için köşesi ince bir noktaya bükülmüş olarak steril bir kağıt havlu veya herhangi bir emici malzeme kullanın. Bu adım, hücre yoğunluğunu yoğunlaştırır, böylece daha küçük enjeksiyon hacimleri elde edilebilir. Ardından, hücre peletini yavaşça çekmek için düşük hacimli (P2 tercih edilir) bir pipet kullanın ve hücre süspansiyonunu hidrofobik bir yüzeye taşımadan önce 1-2 kez ezin. Hacim 1 μl'nin hemen altında olmalıdır. İğnenin ucunu hücre süspansiyonuna hareket ettirin ve hidrolik tahriki kullanarak hücre süspansiyonunu pipete çekin.
- Bir P1 yavrusunu hipotermi yoluyla uyuşturun (bir lateks eldivene sarın ve ~ 2-4 dakika buza koyun). Zararlı bir uyaranla anestezinin etkinliğini kontrol edin. Cildi ince forseps ile ayak parmakları arasında sıkıştırın: yavru sıkışırsa tepkisiz olmalıdır. Daha sonra, yavruyu enjeksiyon cihazının altındaki bir kalıba yerleştirin, ardından cildi kafanın üzerine geri çekerek ve standart laboratuvar bandı ile sabitleyerek cildi gergin hale getirin.
Not: Hipotermi yenidoğan farelerde çok etkili olmasına ve düşük ölüm oranıyla sonuçlanmasına rağmen, yavrular 10 dakikadan kısa sürede iyileşmeye başlayacağı için prosedürler hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Ek olarak, buz üzerinde 4 dakika, tolere edilebilecek olanın bir üst sınırıdır. Enjeksiyonlar için daha uzun bir süre gerekiyorsa hipotermiyi yalnızca bir kez indüklemeye çalışın. Bununla birlikte, bir yavru erken iyileşirse, tekrar hipotermiye neden olmadan önce yavrunun tamamen iyileşmesine izin verin. Ayrıca, enjeksiyonları gerçekleştirmek için sadece bir kez daha hipotermiye neden olun. Yavrular hipotermiden 5-10 dakika sonra iyileşir. Bu, yavruları çöp ve anne ile birlikte yerleştirerek veya yavruları iyileşmek için ılık bir yüzeye yerleştirerek kolaylaştırılabilir.
- Stereotaksik bir cihaz kullanarak, cam pipetin ucunu, başın yüzeyine dik olarak, yavrunun kafasının üzerindeki yüzeye yerleştirin. Pipet kafa ile temas ettiğinde bunu '0' olarak kabul edin. Ardından, pipeti cildin ve kafatasının yüzeyinden kortekse itin, ardından durmadan önce pipeti ~ 2 kez yerleştirin ve geri çekin. Hücrelerin neokortekse en iyi şekilde hedeflenmesi için, mikropipet 0,1 mm derinlikte olduğunda enjeksiyonlar gerçekleştirilir. Ancak, bu kullanıcı tarafından optimize edilmelidir (aşağıdaki nota bakın).
Not: Bu derinlik, yukarıda anlatılan cihazlarla daha derin neokortikal katmanları güvenilir bir şekilde hedeflerken, birkaç derinlik ampirik olarak test edilmeli ve belirlenmelidir. Ek olarak, her bir bölgede hangi derinliğin en uygun olduğunu belirlemek için farklı rostro-kaudal ve medio-lateral pozisyonda bir dizi derinlik test edilmelidir. Ayrıca, neokortekse yavaş penetrasyon dokuya temiz bir şekilde nüfuz etme yeteneğini azalttığı için ilk delinme hızlı olmalıdır. En iyi olanı bulmak için bu prosedüre ilk kez başlarken farklı hızlar deneyin. Ek olarak, koordinatları test etmek için, etiketli hücreleri kullanmanın gerçek bir ikamesi yoktur, çünkü boyalar konumu belirtmek için güvenilmezdir.
- İğne yerine oturduktan sonra, pistonu cam pipete ilerletmek için hidrolik cihazı döndürün ve ayarlanan hacimde hücre süspansiyonunu kortekse itin. Site başına 50-70 nls enjekte edin. Amaç neokorteks boyunca geniş bir hücre dağılımı elde etmekse, bu işlemi farklı rostral-kaudal seviyelerde 3-6 farklı bölgede tekrarlayın.
Not: 100 nl veya daha büyük hacimler lezyonlara neden olabilir ve enjeksiyon bölgesinden verimli bir şekilde dışarı çıkamayan büyük enjekte edilen hücre kümelerine yol açabilir. Bu nedenle, daha küçük enjeksiyon hacimleri (~ 70 nl veya daha az), zaman izin verirse daha fazla site için idealdir.
- Enjeksiyonlar tamamlandığında, yavruyu sahneden çıkarın ve işaretleyin (ayak parmağının kırpılması, yavruları daha sonra tanımlamanın güvenilir bir yoludur). Yavru iyileştiğinde ve kendi başına hareket edebildiğinde (bu, onları sahneden çıkardıktan birkaç dakika sonra gerçekleşir), annesi ve çöpüyle birlikte geri koyun.
Not: Bu minimal invaziv bir prosedür olduğundan, yavru serbestçe hareket ettikten ve ısındıktan sonra ameliyat sonrası herhangi bir prosedür yoktur. Bununla birlikte, yavrular sadece işlemden sonra değil, sağlıklarında herhangi bir bozulma belirtisi olmadığından emin olmak için ertesi gün de kontrol edilmelidir.
- Bir sonraki yavruda prosedüre başlamadan önce, steril bir çalışma alanı sağlamak için alana %70 etanol püskürtün. Enjekte edilen yavruların gelişmesine izin verin ve ardından dokuyu uygun gelişim aşamalarında değerlendirin.
Tablo 1. Reaktiflerin ve araçların envanter listesi. Ortam, diseksiyon araçları, transplantasyon için temsili ekipman ve DNA vektörleri dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen reaktiflerin bir envanteri. (N.A.) Mevcut değil veya uygulanabilir.
| MGE hücre hazırlığı ve transdüksiyonu için reaktifler ve ekipmanlar | Katalog # | Şirket |
| 1) | Dulbecco'nun yüksek glikozlu Modifiye Eagle Medium | 12491-015 | Yaşam Teknolojileri |
| 2) | Isı ile inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu | 10437-077 | Yaşam Teknolojileri |
| 3) | Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS), kalsiyum veya magnezyum içermez | 14170-112 | Yaşam Teknolojileri |
| 4) | 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri (veya kapaklı diğer toplama tüpleri) | 3810X | Eppendorf Uluslararası |
| 5) | Polibren | sc-134220 | SantaCruz Biyoteknoloji |
| 6) | Bıçak bıçağı düz 22,5 ° (isteğe bağlı) | REFERANS 72-2201 | Cerrahi uzmanlık kuruluşu |
| 7) | Petri kabı (10 cm), doku diseksiyonları için | FB0875713 | Fisher Bilimsel |
| 8) | 2 ince uçlu forseps, Dumont #5 gibi | 11254-20 | İnce Bilimsel Araçlar |
| 9) | 37 °C doku kültürü inkübatörü, %5 CO2 girdi | C150 | Bağlayıcı |
| 10) | 1.5 ml mikrosantrifüj tüplerini döndürebilen masa üstü santrifüj | | |
| 11) | Hücre öğütme için kullanılabilecek herhangi bir P1000 pipeti | | |
| 12) | Biyogüvenlik seviyesi 2 başlık | | |
| İn vitro MGE birincil kültürleri için reaktifler ve ekipmanlar | Katalog # | Şirket |
| 1) | Lab-TekII kapaklı hazne kaydırağı, 8 kuyulu | 154941 | Termo Balıkçı |
| 2) | Poli-L-lizin% 0.1 ağırlık / hacim | P8920 | Sigma Aldrich |
| 3) | Fare Laminini, 0.5-2 mg/ml | 23017-015 | Yaşam Teknolojileri |
| 4) | Nörobazal ortam | 21103-049 | Yaşam Teknolojileri |
| 5) | B27 serum içermeyen takviye edici gıda | 17504044 | Yaşam Teknolojileri |
| 6) | Glutamax, 100x hisse senedi | 35050-061 | Yaşam Teknolojileri |
| 7) | Penisilin-Streptomisin, 100x stok | 15070-063 | Yaşam Teknolojileri |
| 8) | Glikoz, (suda% 25'lik bir çözelti hazırlayın) | G5400 | Sigma Aldrich |
| MGE hücre nakli için reaktifler ve ekipmanlar | Katalog # | Şirket |
| 1) | 1 ml şırınga | REF 309602 | BD, Becton Dickinson ve şirketi |
| 2) | 30 1/2 G iğne | 305106 | BD, Becton Dickinson ve şirketi |
| 3) | 5 μl sağlamak için hassas delik (piston ile birlikte gelir) | 5-000-1005 | Drummond bilim şirketi |
| 4) | Parafilm | PM-999 | Polysciences, Inc. |
| 5) ** | Boomstandlı stereo mikroskop | MZ6 | Leica |
| 6) ** | Sadece fareler için dijital stereotaksik alet | 51725D | Hırsızlık şirketi |
| 7) ** | Tek eksenli yağ hidrolik ince mikromanipülatör | MO-10 | Narishige |
| 8) | Elmas kaplı döner beveler | n.a. | evde üretilmiştir |
| 9) | İğne pipet çektirmesi | 730 | Kopf enstrümanları |
| 10) | Mineral yağ | n.a. | Herhangi bir eczane veya eczane |
| 11) | 1 μl hacmi güvenilir bir şekilde ölçebilen herhangi bir pipet ve uç | | |
| ** Bunlar kullandığımız modellerdir, ancak diğer birçok kurulum çalışmalıdır | |
| İsteğe Bağlı Reaktifler (Lentivirus yapmak için) | Katalog # | Şirket |
| 1) | 25 mm, 0,45 μm filtre | 09-719B | Fisher Bilimsel |
| 2) | Ultra şeffaf santrifüj tüpleri (25 x 89 mm) | 344058 | Beckman Coulter® |
| 3) | Lipofektamin 2000 | (1,5 ml boyutunda) | 11668019 | Invitrogen |
| Piyasada bulunan diğer sarf malzemeleri | Katalog # | Şirket |
| 1) | pMDLg/pRRE plazmit kodlama gag/pol | 12251 | Addgene |
| 2) | pRSV-Rev plazmit kodlama Rev | 12253 | Addgene |
| 3) | pMD2.G plazmid kodlaması VSVG | 12259 | Addgene |
| 4) | pAAV-Flex-GFP | 28304 | Addgene |
