$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Ameliyat Öncesi İşlem
- Ameliyata başlamadan önce, steril koşulları korumak için her şeyi% 70 etanol ile silin. Bir ısıtma yastığı kullanılarak termal destek önerilir.
- Fareleri intraperitoneal kloral hidrat (400 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun. Bir ayak parmağını kıstırarak anesteziyi onaylayın. İndüksiyonda meloksikam SR ve iyileşme sonrasında buprenorfin kullanımı BID (bis in die, günde iki kez) en az 24 saat önerilir.
- Saçları cerrahi saç kesme makinesi ile tıraş edin. Kulak çubukları ve burun kelepçesi kullanarak fareye ve yenidoğan sıçan adaptörüne bir fare sabitleyin.
NOT: Bu aşamada fare kafasının emniyete alındığından ve yan yana hareket etmediğinden emin olmak çok önemlidir.
- Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere veteriner merhemi sürün.
2. Kılavuz Kanül İmplantasyonu için Stereotaksik Cerrahi
- Fareyi ve yenidoğan sıçan adaptörünü stereotaksik aparata yerleştirin. Bir neşter kullanarak kafatasının üzerindeki deri üzerinde sagittal olarak bir kesi yapın. Nemli bir pamuklu çubuk kullanarak kafatasındaki kanı ve bağ dokusunu silin.
- Beyin atlasını kullanarak ilgilenilen beyin bölgesinin koordinatını belirleyin. Ölçümlere başlamadan önce, matkap ucunun AP hareket ettirilebilmesi ve tüm zaman boyunca orta hat sütürü üzerinde kalabilmesi için orta hattın düz olduğundan emin olun.
NOT: Bu makale, posterior hipokampusu hedeflemek için koordinatı (A/P: -3.1 mm, M/L: -2.5 mm, D/V: -1.2 mm, 12 derece) kullanır.
- Seviye kafatası AP
- Stereotaksik bir çerçevenin manipülatörüne bir matkap takın. Matkabı lambdaya hafifçe dokunana kadar indirin ve ventral koordinatını kaydedin. Bregma için bu prosedürü tekrarlayın.
NOT: Kafatası düzleştirildiğinde, bregmanın dikey ölçümü lambdanınkine eşittir. Değilse, burun kelepçesinin yüksekliğini buna göre ayarlayın. Kafatası düzleştikten sonra, bregmanın ön / arka, yan koordinatını kaydedin.
- Seviye kafatası sol-sağ
- Matkabı bregma'dan koordinata getirin (Ön-arka [A/P]: -3,1 mm, mediolateral [M/L]: +2,0 mm), matkabı kafatasına indirin ve dikey koordinatı kaydedin. Ardından koordinat için bu prosedürü tekrarlayın (A/P: -3,1 mm, E/L: -2,0 mm).
NOT: Kafatası düz ise, orta hattan eşit uzaklıktaki iki noktanın bu dikey ölçümleri eşittir. Değilse, kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayın.
- Bir kılavuz kanül implante etmek için hedef koordinatta (A/P: -3.1 mm, M/L: -2.5 mm) dikkatlice bir çapak deliği açın. Bir çapak deliğinin çapı bir kılavuz kanül implantasyonu için yeterince büyük değilse, birincisiyle çakışan başka bir delik açın. Sağ (karşı taraf) parietal kemikte başka bir delik açın ve diş çimentosunu 1.10'da sabitlemeye yardımcı olan bir kemik vidası yerleştirin (Bkz. Şekil 1B).
- 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünün kapağının arka tarafından bir tıraş bıçağı ile dairesel bir kilitleme parçası kesin ve bir ''taç'' yapın. Bu taç, diş çimentosunun cilde yayılmasını önlemek için kullanılır. Adım 2.5'te açılan çapak delikleri dairenin içinde kalacak şekilde kafatasının üzerine yerleştirin (Bkz. Şekil 1).
- Stereotaksik adaptörün kısa koluna bir kılavuz kanül koyarak stereotaksik bir düzenek kurun ve bir başlık somunu kullanarak sabitleyin. Stereotaksik adaptörün daha uzun kolunu elektrot kelepçesine yerleştirin. Stereotaksik aparatın manipülatörüne takın (Bkz. Şekil 1A).
- Manipülatör kolundaki dorsal-ventral (DV) stereotax tertibatını 12 derece döndürün (Bkz. Şekil 1B). Kılavuz kanülü 1.6'da yapılan çapak deliğine hareket ettirin. Kılavuz kanülü 1,2 mm alçaltarak beyne yavaşça yerleştirin.
NOT: Probun açısı hipokampusa özgüdür; Diğer bölgeler başka açılar gerektirebilir veya hiç açı gerektirmeyebilir. Kesin koordinatlar için bir beyin atlasına danışın. Kafatasının yüzeyini kurutun, çünkü aksi takdirde çimento yapışmaz ve çimento kapağı yerinden çıkabilir
- Hem kılavuz kanülün metal kısmını hem de kemik vidasını onları sabitleyecek kadar tamamen kaplayacak şekilde diş çimentosunu taç içine ekleyin. Kafatasının bir kısmı açıkta kalmışsa ek diş çimentosu uygulayın.
- Diş çimentosu tamamen kuruyana kadar bekleyin (~ 12-20 dk). Stereotaksik adaptörü elektrot kelepçesinden çıkarın. Başlık somununu çıkarın ve stereotaksik adaptörü sahte bir probla değiştirin ve başlık somununu sıkın.
- Fareyi stereotaksik cihazdan serbest bırakın ve fareyi tek başına ayrı bir kafeste saklayın.
NOT: Fare, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmamalıdır. Mikrodiyaliz gününe kadar fareyi her gün kontrol edin. Fare, acı çekiyor gibi görünüyorsa, carprofen gibi steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) alır. Farenin yeni ortama alışması için uyku-uyanıklık çalışmaları için 2 hafta beklemek gereklidir, ancak diğer çalışma türleri daha kısa iyileşme süreleri gerektirebilir ( örneğin, 1-2 gün).
3. Mikrodiyaliz Kurulumu
- Probların kalite kontrolü: Tek kullanımlık 1 ml'lik bir şırıngayı damıtılmış suyla doldurun ve bir byton tüpü kullanarak bir probun çıkışına (daha kısa bağlantı noktası) bağlayın. Havalandırma deliklerini parmaklarınızla kapatın ve proba su vermek için şırınga pistonuna hafifçe bastırın. Prob girişinden su gelip gelmediğini ve mikrodiyaliz membranının yüzeyinde sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
- Probların aktivasyonu: Bir probun zarlarını iki saniye boyunca etanole (% 70-100) batırın. Ardından, damıtılmış suyu tekrar bir şırınga ile proba tekrar demleyin.
- Perfüzyon tamponunun hazırlanması: Hedef moleküllerin borulara yapışmasını önlemek için,% 30 BSA çözeltisini yapay beyin omurilik sıvısı ile% 4'e% 4'e seyrelterek BSA ekleyin (aCSF: 1.3 mM CaCl2, 1.2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH=7.35), kullanımdan hemen önce BOS'taki elektrolit konsantrasyonuyla yakından eşleşir. Perfüzyon tamponunu 0.1 μm gözenek boyutuna sahip bir şırınga filtre ünitesinden süzün.
NOT: %4 sığır serum albümini (BSA), yapışan proteinler için iyileşmeyi iyileştirir, ancak özellikle yüksek BSA bağlanmasına sahip bileşikler için bileşiklerin verilmesini ciddi şekilde sınırlayabilir. Bu, bazı durumlarda daha düşük BSA konsantrasyonu (%0,15 gibi) kullanmanın bir avantajıdır. BSA'nın girdap veya karıştırma plakası ile çalkalandığında çok kolay bir şekilde toplanabileceğini unutmayın. Bu agregalar probları veya membran gözeneklerini tıkayabilir. Bu toplamayı sınırlamak için bir BSA çözümü hazırlarken dikkatli olun
- Giriş ve çıkış için iki ayrı hat hazırlayın (Bkz. Şekil 1C) ve her iki hattı bir bağlantı iğnesi ile bağlayın. Perfüzyon tamponu ile doldurulmuş tek kullanımlık 3 mL'lik bir şırıngayı doldurun ve künt uçlu bir iğne kullanarak borunun giriş ucuna bağlayın. Şırınga pompasını çalıştırarak tüm boruyu bir perfüzyon tamponu ile doldurun.
- Şırınga pompasını durdurun ve giriş hattı ile çıkış hattı arasındaki bağlantı iğnesini adım 3.3'teki aktif bir mikrodiyaliz probu ile değiştirin (Bkz. Şekil 1C). Bu değiştirmeden önce, başlık somununu probun üzerine yerleştirin.
- Silindir borusunu silindir pompasındaki çıkış borusuna monte edin. Şırınga pompasını 10 μL/dk'da ve ardından makaralı pompayı biraz daha yavaş akış hızında (9,5-9,8 μL/dk) başlatın. Tüm borudaki tüm hava kabarcıklarını çıkardığınızdan emin olun, bu da proba girdiklerinde toparlanmayı etkileyebilir.
- Fareyi adım 1.12'den itibaren adım 1.2'deki gibi uyuşturun. Fare tasmasını boynuna geçirin. Başlık somununu ve kukla probu çıkarın ve kılavuz kanülden 3.4'ten bir mikrodiyaliz probunu yavaşça sokun ve başlık somununu sıkın.
- Fareyi serbest hareket eden bir sisteme bağlı kafese yerleştirin ve fareyi tasma ile bağlayın. Hem şırınga pompasını hem de makaralı pompayı en az 1 saat boyunca adım 3.5'te belirtilen akış hızında çalıştırmaya devam edin.
NOT: Uyanık hayvanlardan ISF toplamayı elde etmek için bu makale, kafesin kendisinin boruların bükülmesini önlemek için bir hayvanın hareketine yanıt verdiği serbest hareket eden bir sistem kullanır. Alternatif olarak, çeşitli şirketlerden temin edilebilen sıvı fırdöndüler de kullanılabilir.
- Önce makaralı pompayı, ardından şırınga pompasını durdurun. İstenen akış hızını ayarlayın. Şırınga pompasını silindir pompasından %20 daha hızlı çalıştırın.
NOT: Örneğin, 1 μL/dk'da çalışıyorsanız, şırınga pompasını 1,2 μL/dk'da çalıştırın. Optimal akış hızı, her molekül için ampirik olarak belirlenmelidir.
- ISF numunelerinin toplanması: çıkış borusunun serbest ucunu soğutmalı fraksiyon toplayıcıya yerleştirin.
NOT: Uygun numune hacmi, analiz için kullanılan tahlillere bağlı olarak değişir.
- Deneyin tamamlanmasından sonra probu çıkarın. (Fareyi gerektiği gibi uyuşturun.)Fare kurtarma işlemini adım 2.11'deki gibi gerçekleştirin. Toplanan İDF'yi yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) veya enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi yöntemlerle analiz edin.
- Mikrodiyalizden sonra tüm boruyu yıkamak için, probu bağlantı iğnesi ile değiştirerek giriş ve çıkış borularını tekrar bağlayın ve seyreltilmiş ağartıcıyı tüm boruda çalıştırın ve ardından suyla yıkayın. Kurutun ve tekrar tekrar kullanmak üzere saklayın.
NOT: Diğer boru türleri kabul edilebilir, ancak perfüzyon tamponundaki BSA, küçük çaplı boruları tıkayabilir, bu nedenle bu borular tek kullanımlık olarak kabul edilir. Borular birden fazla kullanımdan sonra aşınabilir veya tıkanabilir, bu nedenle kullanmadan önce akış hızının her seferinde tutarlı olduğundan emin olun.
