1. Hücrelerin Floresan Etiketlemesi
NOT: Glioblastoma hücre hatlarını ve mikrogliaları floresan boyalarla etiketleyin 9. Alternatif olarak, GFP / RFP gibi floresan proteinleri yapısal olarak ifade eden hücre hatları oluşturun.
- 6 oyuklu bir plaka üzerindeki plaka hücreleri, boyama gününde% 70 - 80 birleşecek şekilde plaka hücreleri. Murin glioblastoma hücre hattı GL261 ve insan glioblastoma hücre hattı U87 için, boyamadan 24 saat önce 6 cm'lik bir tabak üzerinde sırasıyla 1 x 106 ve 1.5 x 106 hücre plaka.
- DMSO'da (Dimetil sülfoksit) floresan hücre leke boya çözeltisi hazırlayın ve ortama, Roswell Park Memorial Institute ortamına (RPMI) veya Makrofaj Serum Serbest Ortama (MSFM) 5 μM boya ekleyin, girdap kuyusu.
- Hücreleri 37 °C'de 30 dakika boyunca boya ile inkübe edin ve% 5 CO2.
- Boya içeren ortamı çıkarın ve hücrelere taze ortam (RPMI veya MSFM) ekleyin.
- Hücreleri 30 dakika inkübe edin. Not: Hücreler artık boyanmıştır ve deneyde kullanılmaya hazırdır.
2. İnvazyon Testi "3D" Matriste Glioma ve Makrofajlar/Mikroglia
- Matris karışımını gece boyunca 4 °C'de çözdürün. Kaputtaki buz üzerinde bir matris kullanarak diğer tüm manipülasyonları gerçekleştirin.
- Buz üzerinde% 0.3 BSA ile ortamda (MSFM veya RPMI) 10 mg / ml matris konsantrasyonu hazırlayın.
NOT: Matrisin stok konsantrasyonu tipik olarak yaklaşık 15 mg/ml'dir.
- Matriste süspansiyon için hücreleri (adım 1'de etiketlenmiş) hazırlamak için, ortamı aspirasyon yoluyla hücrelerden çıkarın. Hücreleri 2 mM EDTA (Etilendiamin tetraasetik asit)/PBS (Fosfat tamponlu tuzlu su) ile bir tabakta yıkayın. Hücrelere 500 μl 2 mM EDTA/PBS ekleyin ve 37 °C ve% 5 CO2'da 5 - 10 dakika inkübe edin.
- % 0.3 BSA içeren 5 ml ortamdaki hücreleri yeniden süspanse edin.
- 120 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı peletten aspire edin. Hücre konsantrasyonu 1 x 106 hücre/ml'ye eşit olacak şekilde peleti ortam/%0.3 BSA'da yeniden süspanse edin. Hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.
- 1,5 ml'lik bir mikrofüj tüpüne 1,5 x 105 GL261 hücresi (150 μl'de) + 5 x 104 mikroglia hücresi (50 μl'de) ekleyin. 2 x 105 GL261 hücresini (200 μl) ayrı bir 1,5 ml mikrofüj tüpüne ekleyin.
NOT: GL261 hücreleri mikroglia içermeyen tek başına bir kontrol görevi görür.
- Hücreleri 120 x g'da 5 dakika boyunca bir mikrofüje döndürün.
- Hücreleri buz üzerinde 200 μl soğuk matriste yeniden süspanse edin.
- 50 μl (50.000 hücre) plaka, 8 μM gözenek boyutundaki hazne ekinin üst bölmesinin ortasına yerleştirin.
- Polimerizasyonun gerçekleşmesi için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
- Üst hazneye 200 μl serumsuz ortam ve alt oyuğa 700 μl serum içeren hücre büyüme ortamı ekleyin.
- 37 °C'de, %5 CO2'da 48 saat
inkübe edin
- İnkübasyondan sonra, hücreleri yumuşak aspirasyon ile odanın üstünden çıkarın ve odaları PBS'de% 3.7 formaldehit içine yerleştirerek sabitleyin. Odaların oda sıcaklığında (veya gece boyunca 4 ° C'de) 15 dakika fiksatif kalmasına izin verin. Fiksatifi hafif aspirasyonla çıkarın ve 500 μl 1x PBS ile değiştirin. Görüntü analizi için bölüm 4'e geçin.
