Fetal Nöral Kök Hücrelerin Zika Virüsü Enfeksiyonu

Özet

Kaynak: McGrath, E. L., et al., İmmünositokimyasal Analiz için Kültürlenmiş İnsan Fetal Beyin Nöral Kök Hücrelerinin Zika Virüsü Enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, insan fetal nöral kök hücrelerini Zika virüsü ile enfekte etmek için bir prosedürü göstermektedir. Enfekte olmuş hücreler daha ileri çalışmalar için kullanılabilir.

Protokol

1. Zika Virüsü Enfeksiyonu

NOT: ZIKV sıcaklığa karşı oldukça hassastır, bu nedenle ZIKV stokunun -80 °C'de saklanması ve donma/çözülme döngülerinden kaçınılması zorunludur. Buz üzerinde çalışmaya devam edin.

1. Geçiş hücreleri. 24 oyuklu bir plakayı tohumlamak için toplam 3-4 milyon hücreye ihtiyaç vardır, bu nedenle geçerken, enfeksiyon ve tohumlama için gereken hücre sayısını geçerken bir şişeye koyun.
2. Hücreleri boyama için 24 oyuklu bir plakaya ekiyorsanız, plakayı hazırlayın [Örtü fişleri içeren kuyucukları steril suda %0.01 poli-D-lizin (PDL) ile kaplayın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. 24 oyuklu bir plaka için, oyuk başına 250 μL PDL kullanın].
3. Geçtikten sonra, 1.5 mL hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve oda sıcaklığında 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Sonra süpernatanı aspirasyon ile çıkarın.
4. 1 ila 10 arasında bir enfeksiyon çokluğu (MOI) elde etmek için ZIKV stoğundaki hücre peletini yeniden askıya alın. ZIKV çözeltisinin hacmi 0,5 mL'yi geçmemelidir. Sahte tedavi (kontrol hücreleri) için, ZIKV stoğunda kullanılan aynı hacim ve ortam tipindeki hücreleri yeniden süspanse edin.
5. Hücre / ZIKV karışımının üzerinde 37 ° C'de 1 saat inkübe edin. Tüpü 2-3 kez ters çevirin ve ardından bir hücre peleti elde etmek için karışımı oda sıcaklığında 216 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Peleti dPBS'de yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 216 x g'da 5 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin.
6. Süpernatanı aspirasyon ile çıkarın, hücreleri uygun ortamla yeniden süspanse edin ve enfekte olmuş hücreleri deney için gerekli olan şişeye veya plakaya yükleyin. Hücreleri 24 oyuklu bir plakaya ekiyorsanız, peleti 12 mL uygun ortamda yeniden süspanse edin ve ardından her oyuğa 500 μL süspansiyon ekleyin.
   NOT: Bu noktada, ZIKV'nin kök hücreler üzerindeki etkilerini gözlemlemek için hücreleri büyüme ortamında tutun veya ZIKV'nin farklılaşma süreci üzerindeki etkisini incelemek için 6. veya 7. adımlara gidin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
Glikoz (%10)	Sigma	G8644
HEPES (1M)	Corning/cellgro	25-060-c1
Kalem Strep (100x)	Gibco	15140-122
Karbondioksit inkübatörü	Termo Forma	Model# 3110
Santrifüj	Thermo fisher Bilimsel	75004221
Biyolojik güvenlik kabini	Forma scientific Claas II A/B3	Model# 1284
Poli-D-Lizin hidrobromür (PDL)	Sigma	P6407-5MG
Laminin	Invitrogen	23017-015