Dorsal Kök Ganglion Duyusal Nöronlarının Bir Nöropeptit Reseptör Agonisti Kullanılarak Uyarılması

Özet

Kaynak: Lin, Y., et al., Dorsal Kök Ganglion İzolasyonu ve Nörotransmitter Salınımını İncelemek İçin Birincil Kültür. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, bir nöropeptit reseptör agonisti ile uyararak nörotransmitter salınımını incelemek için transfekte edilmiş dorsal kök ganglion hücrelerinin kullanımını göstermektedir.

Protokol

1. Primer DRG Hücrelerinden Nörotransmiterlerin Salınımı

1. 6. Günde, hücreler kaplandıktan sonra (siRNA transfeksiyonundan 72 saat sonra), kültür ortamını 200 μL serumsuz ortama değiştirin ve hücreleri 37 °C CO₂ inkübatörde 30 dakika.
2. 1 μL stimülasyon kimyasalı (kimyasalları) ekleyin ve ortamı pipetleyerek nazikçe karıştırın. Çanağı 37 °C CO₂ inkübatörde belirlenen süre boyunca inkübe edin.
   NOT: Bu makalede, kültürlenmiş hücreler NPFFR2 agonisti dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Leu-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 nmol) ile 1 saat süreyle uyarıldı.
3. Kültür ortamını kültür kabından toplayın ve asılı safsızlıkları gidermek için 5,000 x g sıcaklıkta 4 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin.
4. Süpernatanı santrifüjden toplayın ve numuneleri gerektiği gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin. Ardından, nörotransmiterlerin seviyelerini test etmek için enzim immünoassay (EIA) kitlerini kullanın.
   NOT: Burada, süpernatanlar CGRP seviyesini analiz etmeden önce 1:100 oranında seyreltildi. Süpernatant, SP seviyesini analiz etmeden önce seyreltilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Kültür Ortamı
Hank'in dengeli tuz çözeltisi	Invitrogen	14170-112	Kültür Ortamı
Pasteur pipeti	Hilgenberg	3150102	Hücre tritürasyonu
dNPA	Genemed Synthesis	Yok	NPFFR2 agonisti